قمنا بتطوير منهجية ل3D الكمي في النمذجة سيليكون (q3DISM) من دماغي اميلويد β (Aβ) البلعمة من قبل البالعات وحيدات النوى في نماذج القوارض من مرض الزهايمر. ويمكن تعميم هذه الطريقة لتحديد الكميات من أي بلعمة تقريبا في الجسم الحي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
3D الكمي في السيليكو النمذجة (q3DISM) من الدماغيه اميلويد بيتا البلعمة في نماذج القوارض من مرض الزهايمر
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتم الاعتراف Neuroinflammation الآن باعتباره عاملا مسببا رئيسيا في الأمراض العصبية التنكسية. البالعات وحيدات النوى هي الخلايا المناعية الفطرية المسؤولة عن البلعمة وإزالة الأنقاض والمخلفات. وتشمل هذه الخلايا الضامة الجهاز العصبي المركزي المقيمين المعروفة باسم الخلايا الدبقية الصغيرة، والبالعات وحيدات النوى التسلل من المحيط. وعموما استخدمت المجهر الضوئي لتصور البلعمة في القوارض أو عينات الدماغ البشري. ومع ذلك، لم تقدم الطرق النوعية دليل قاطع في الجسم الحي البلعمة. هنا، نحن تصف 3D الكمي في النمذجة سيليكون (q3DISM)، وسيلة قوية تسمح الكميات 3D الحقيقية للاميلويد β (Aβ) البلعمة من قبل البالعات وحيدات النوى في القوارض مرض الزهايمر (AD) نماذج. الطريقة ينطوي على fluorescently تصور Aβ مغلفة ضمن جسيم حال بلعمي في أقسام الدماغ القوارض. مجموعات البيانات مبائر كبيرة زي الأبعاد ثم يتم بناؤها 3D لتحديد الكميات من A &# 946؛ colocalized مكانيا داخل يحلول يبلوعي. ونحن لشرح التطبيق الناجح لq3DISM إلى الماوس والفئران العقول، ولكن يمكن تمديد هذه المنهجية إلى أي بلعمة تقريبا في أي نوع من الأنسجة.
المقدمة
مرض الزهايمر (AD)، والأكثر شيوعا المرتبطة بالعمر الخرف 1، يتميز تراكم الدماغية اميلويد β (Aβ) كما ويحات "خرف"، β اميلويد، المزمن neuroinflammation على مستوى منخفض، tauopathy، وفقدان الخلايا العصبية، واضطراب الإدراك 2 . في ميلادي أدمغة المرضى، وخصصت neuroinflammation بواسطة الخلايا النجمية والبالعات وحيدات النوى رد الفعل (ويشار إلى الخلايا الدبقية الصغيرة، على الرغم من المركزية مقابل الأصل المحيطي يزال غير واضح بهم) المحيطة الودائع Aβ 3. كما رقيب المناعة الفطرية للجهاز العصبي المركزي، يتم وضع الخلايا الدبقية الصغيرة مركزيا لمسح الدماغ Aβ. ومع ذلك، ويرافق التوظيف دبقية لويحات Aβ بواسطة القليل جدا،....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد وافق جميع التجارب التي تنطوي على الحيوانات بالتفصيل في هذه الوثيقة من قبل جامعة جنوب كاليفورنيا المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC)، وأجرى بما يتفق بدقة مع المعاهد الوطنية للإرشادات الصحة والتوصيات الصادرة عن جمعية للتقويم والاعتماد للمختبر: بيان من أخلاقيات البحث رعاية الحيوان الدولية.
1. القوارض عزل الدماغ والتحضير لالمناعية
اليوم 1:
- ضع الذين تتراوح أعمارهم بين الفئران TgF344-AD (من العمر 14 شهرا) أو APP / الف....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام منهجية متعددة المراحل لq3DISM المفصلة أعلاه، ونحن قادرون على تحديد Aβ امتصاص إلى جسيم حال بلعمي الوحيدات في أدمغة APP / الفئران PS1 (الشكل 1) والجرذان TgF344-AD (الشكل 2). ولذلك، فقد مكنت منهجية q3DISM تحليل البالعات وحيدات النوى في الماوس والفئران نماذج من م. ومن المثير للاهتمام، وزاد حجم التداول بنسبة CD68 + جسيم حال بلعمي المحتلة بشكل كبير في Iba1 + البالعات وحيدات النوى المرتبطة م.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
البروتوكول الذي وصفنا في هذا التقرير لتحديد الكميات 3D الحقيقية للAβ البلعمة في الحي بواسطة البالعات وحيدات النوى يعتمد على وضع العلامات المحددة من المقصورات الخلوية والتحت خلوية وكذلك الودائع Aβ. على وجه التحديد، ونحن نستخدم Iba1 (مؤين الكالسيوم ملزم محول جزيء 1)، وهو البروتين الذي يشارك في الإزعاج غشاء والبلعمة على تنشيط الخلايا 18، 19، إلى وصمة عار البالعات وحيدات النوى الدماغية. في حين تعتبر خلايا Iba1 + عموما الخلايا الدبقي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
< ص الفئة = 'jove_content'> م -في. جي إس. مدعوم من قبل جائزة زمالة أبحاث مرض الزهايمر (A2015309F) وجمعية الزهايمر ، جائزة الباحث الشاب لفرع كاليفورنيا ساوثلاند. يتم دعم T.M.W. من قبل مؤسسة ARCS ومؤسسة جون دوغلاس الفرنسية لمرض الزهايمر ماجي ماكنايت راسل - JDFAF التذكارية لما بعد الدكتوراه. تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (1R01NS076794-01 ، إلى TT ) ، وجائزة زميل زينيث لجمعية الزهايمر (ZEN-10-174633 ، إلى TT) ، وجائزة الاتحاد الأمريكي لأبحاث الشيخوخة / مؤسسة إليسون الطبية جولي مارتن في منتصف حياتها المهنية في أبحاث الشيخوخة (M11472 ، إلى TT). نحن ممتنون لتمويل بدء التشغيل من معهد زيلخا للوراثة العصبية ، والتي ساعدت في جعل هذا العمل ممكنا. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Isoflurane | Abbott | NDC 0044-5260-05 | |
| مقص تشريح | VWR | 82027-582 | |
| مقص تشريح طرف حاد | VWR | 82027-588 | |
| ملاقط | VWR | 94024-408 | |
| 23 G إبرة | VWR | BD305145 | |
| مضخة تمعجية FH10 | Thermo Scientific | 72-310-010 | |
| PBS 10x | Bioland Scientific | PBS01-02 | محلول ملحي مخزن بالفوسفات ؛ تركيز العمل 1x |
| مصفوفة دماغ الفأر البالغ ، شرائح الإكلالية ، الفولاذ المقاوم للصدأ 1 مم ؛ | كينت Scientific | RBMS-200C | |
| مصفوفة دماغ الفئران البالغة ، شرائح إكليلية ، ستانلس ستيل 1 مم ؛ | كينت العلمية | RBMS-305C | |
| محلول مائي بارافورمالدهايد 32٪ (PFA) EMS | 15714-S | تحذير: سام. تركيز العمل: 4٪ في PBS | |
| Ethanol | VWR | 89125-188 | تركيزات مختلفة ، انظر بروتوكول |
| Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura | VWR | 25608-774 | |
| تضمين وتسلل Paraffin | VWR | 15147-839 | |
| Microtome Leica RM2125 | Leica Biosystems | ||
| شفرات Microtome يمكن التخلص منها ؛ | VWR | 25608-964 | |
| حمام مائي لايكا HI 1210 | Leica Biosystems | ||
| Micro slide Superfrost plus | VWR | 48311-703 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4X4L | تحذير: سامة |
| حل استرجاع الهدف 10x | DAKO | S1699 | تركيز العمل 1x |
| KimWipes | VWR | 21905-026 | |
| قلم PAP مسعور | VWR | 95025-252 | |
| Triton X-100 | VWR | 97062-208 | |
| مصل الحمار العادي (NDS) | Jackson Immuno | 017-000-121 | |
| Coverslips | VWR | 48393081 | |
| إطالة كاشف الذهب المضاد للبهتان باستخدام DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| رف منزلق زجاجي | VWR | 100492-942 | |
| الجسم المضاد Iba1 (متعدد النسيلة ، الأرنب) | واكو | 019-19741 ؛ | تركيز العمل 1:200 |
| الجسم المضاد Iba1 (متعدد النسيلة ، الماعز) | LifeSpan Bioscience | LS-B2645 | تركيز العمل 1: 200 |
| الفئران CD68 [KP1] الجسم المضاد (أحادي النسيلة ، الفأر) Abcam | ab955 | تركيز العمل 1: 200 | |
| فأر CD68 [FA-11] الجسم المضاد (أحادي النسيلة ، الفئران) Abcam | ab53444 | تركيز العمل 1: 200 | |
| فأر CD107a (LAMP1) الجسم المضاد (أحادي النسيلة ، الفئران) Affymetrix | 14-1071 | تركيز العمل 1: 100 | |
| بيتا أميلويد ، 17-24 (4G8) جسم مضاد (أحادي النسيلة ، فأر) | Covance | SIG-39220 | تركيز العمل 1: 200 |
| بيتا أميلويد ، 1-16 (6E10) جسم مضاد (أحادي النسيلة ، فأر) | Covance | SIG-39320 | تركيز العمل 1: 200 |
| OC الجسم المضاد (متعدد النسيلة ، الأرنب) | موهوب من قبل DH Cribbs و CG Glabe (UC Irvine) تركيز | العمل 1: 200 | |
| Alexa Fluor 488 الجسم المضاد الثانوي للفأر | Invitrogen | A-11001 | تركيز العمل 1: 1,000 |
| Alexa Fluor 488 الفئران الجسم المضاد الثانوي | Invitrogen | A-11006 | تركيز العمل 1: 1,000 |
| Alexa Fluor 594 الأرانب الجسم المضاد الثانوي | Invitrogen | A-11037 | تركيز العمل 1: 1,000 |
| Alexa Fluor 594 الجسم المضاد الثانوي للماعز | Invitrogen | A-11080 | تركيز العمل 1: 1,000 |
| Alexa Fluor 647 الجسم المضاد الثانوي للفأر | Invitrogen | A-21235 | تركيز العمل 1: 1,000 |
| Alexa Fluor 647 الأرانب الجسم المضاد الثانوي | Invitrogen | A-21443 | تركيز العمل 1: 1,000 |
| زيت الغمر | نيكون & nbsp ؛ | ||
| A1 مجهر متحد البؤر | نيكون | ||
| NIS Elements برامج البحث المتقدمة | نيكون | ||
| Imaris: يتم استخدام وحدة برنامج Bitplane الإصدار 7.6 | Bitplane | "coloc" و "supass". بدلا من ذلك ، البرمجيات المجانية مفتوحة المصدر يمكن استخدام ImageJ للتوطين المشترك تحليل مجموعات بيانات Z-stacks متحدة البؤر. |
المراجع
- Brookmeyer, R., et al. National estimates of the prevalence of Alzheimer's disease in the United States. Alzheimers Dement. 7 (1), 61-73 (2011).
- Selkoe, D. J. Alzheimer's disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
- Heneka, M. T., G....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
