הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

קולון-26 קרצינומה גידול נושאות עכבר כמודל לחקר סרטן תשישות

16.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54893

⸱

30 בנובמבר 2016

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, Simon Cancer Center and IUPUI Center for Cachexia Research, Innovation and Therapy, Indiana University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

עכברים הנושאים את קרצינומת המעי הגס-26 (C26) מייצגים מודל קלאסי של קאשקסיה סרטנית. דלדול שרירים מתקדם מתרחש בקשר לצמיחת גידול, ביטוי יתר של יוביקוויטין ליגאזות ספציפיות לשריר והפחתה באזור חתך השריר. נצפה גם אובדן שומן. קאשקסיה נחקרת באופן תלוי זמן עם חומרת בזבוז הולכת וגוברת.

תקציר

Cancer cachexia הוא אובדן מתקדם של מסת שריר השלד ורקמת השומן, מאזן חנקן שלילי, אנורקסיה, עייפות, דלקת והפעלת מערכות ליפוליזה ופרוטאוליזה. חולי סרטן עם קאשקסיה מפיקים תועלת פחותה מטיפולים אנטי-ניאופלסטיים ומראים תמותה מוגברת1. מספר מודלים של בעלי חיים הוקמו על מנת לחקור את הגורמים המולקולריים האחראים לדלדול הגוף והשרירים כתוצאה מגידול הגידול. כאן, אנו מתארים מתודולוגיות הנוגעות למודל מאופיין היטב של קאשקסיה סרטנית: עכברים הנושאים את קרצינומה C262-4. למרות שמודל זה נמצא בשימוש נרחב במחקר קאשקסיה, גישות שונות הופכות את השחזור לבעיה פוטנציאלית. צמיחת הגידול C26 גורמת לאובדן ניכר ומתקדם של מסת שריר הגוף והשלד, המלווה בהפחתת שטח חתך השרירים וכוח השרירים3-5. גם רקמת השומן הולכת לאיבוד. הבזבוז מתרחש במקביל לרמות גבוהות במחזור הדם של ציטוקינים פרו-דלקתיים, במיוחד אינטרלוקין-6 (IL-6)3, האחראי ישירות, אם כי לא לגמרי, לקאשקסיה C26. מקובל היטב כי מנגנון ראשוני שבאמצעותו גידול C26 גורם לדלדול רקמת השריר הוא הפעלת מערכות פרוטאוליטיות של שרירי השלד. לפיכך, ביטוי של ליגאזות יוביקוויטין ספציפיות לשרירים, כגון אטרוגין-1/MAFbx ו-MuRF-1, מייצגים שיטה מקובלת להערכת קטבוליזם השרירים המתמשך2. כאן, אנו מציגים כיצד לבצע את המודל הזה בצורה הניתנת לשחזור וכיצד לכרות מספר רקמות ואיברים (הכבד, הטחול והלב), כמו גם שרירי שומן ושלד (הגסטרוקנמיוס, הטיביאליס הקדמי והארבע ראשי). אנו מספקים גם פרוטוקולים שימושיים המתארים כיצד לבצע הקפאת שרירים, חתך וכימות גודל סיבים.

מבוא

לבזבז שריר הוא סיבוך חמור של מצבים רפואיים שונים, כגון סרטן, אלח דם, כבד, שחמת כבד, לב ואי ספיקת כליות, מחלת ריאות חסימתית כרונית, ואיידס. בפרט, מבזבז שרירים ניכרת לפחות 50% מהחולים עם סרטן 1. פסד של שרירי שלד בתוצאות הסרטן מפני שפלת חלבון מוגברת בשל יתר ההפעלה של מערכות פרוטאוליטים שרירי שלד ו / או ירידת חלבון סינתזה 6. ליפוליזה ניכרה גם, מה שמוביל הדלדול של רקמת שומן. תשישות קלינית, קשורה באיכות מופחתת ואורך החיים מוערך סיבת המוות ב 20 - 30% מהחולים בסרטן 7. שימוש במודלים ניסיוניים הדומות למחלות האנושיות ככל האפשר יהיה מועיל. במודל חיה אופטימלי מאופיין שחזור גבוה, כמו גם על ידי התערבות מוגבלת מטיפולים שונים והגורמים הצפויים שלדיאטה, מין, ועל רקע גנטי כי הם בדרך כלל משויכים מצבו הקליני 8. עד כה, תשישות הסרטן נחקרה בעיקר במודלים של בעלי חיים המאופיינת השתלה של תאים סרטניים או הזרקה של חומרים מסרטנים, למרות שיטה חדשה היא להשתמש מהונדסים גנטיים עכברים רגישים להתפתחות הסרטן.

בעכברים נושאי קרצינומה C26 (המכונה גם נקודתיים-26 ו אדנוקרצינומה) מייצגים מודל היטב מאופיין בהרחבה בשימוש של תשישות סרטן 2,5. הצמיחה של תוצאות הגידול C26 בגוף וירידה במשקל שרירים, בעיקר באמצעות שומן משופרת חלבון פירוק 9. באופן כללי, משקל גידול 10% לעומת משקל גוף הכולל קשור לירידה של 20-25% ממשקל שרירי שלד דלדול יותר של שומן 3,10. Hepatomegaly ו splenomegaly הם נצפו גם עם צמיחת הגידול, יחד עם הפעלת התגובה בשלב החריף ואת הגובה של infla פרורמות ציטוקינים mmatory 3,11. בין אלה, זה ידוע היטב כי IL-6 ממלא תפקיד מרכזי בתיווך לבזבז שריר במודל C26, למרות ציטוקינים זה הוא כנראה לא inducer רק של תשישות 12. מוגבה IL-6 הגורם לניוון שרירים דרך שפעול מסלול JAK / STAT3, עיכוב גורם שעתוק זה יכול למנוע שריר מבזבז 3,4.

במהלך לבזבז שרירים הנגרמת C26, כמו במצבים רבים של ניוון שרירים, מסת שריר הוא איבד בעיקר באמצעות הפחתת תכולת החלבון בשריר פני סיבי השריר, ולא דרך מוות של תאים או אובדן סיבי 13. בשנת תשישות C26, תזוזה לעבר אזורים חתך קטן הוא ציין הן בסיבים glycolytic חמצוני 2. זה גם עולה בקנה אחד עם כוח שרירים מופחת 5. קבוצות רבות ברחבי העולם לקחו את היתרון של מודל C26 כדי לגלות מתווכים חדשים של בזבוז שריר או תרופות רלוונטיות קלינית עבור CAC סרטןhexia. עם זאת, נהלים שונים עבור השימוש במודל זה דווחו, מעלה חששות על העקביות של הנתונים שהתקבלו פוזות חסמי שחזור בתנאי ניסוי שונים. כאן אנו מדווחים על שימוש טיפוסי של מודל זה לחקר תשישות הסרטן אשר מניבה נתונים מותאמים לשחזור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

משפט ואתיקה: כל המחקרים שתוארו אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש ועדות של אוניברסיטת תומס ג'פרסון אינדיאנה הספר לרפואה של אוניברסיטת.

1. צמיחת תאי C26 והכנה

  1. להשיג תאים סרטן המעי הגס C26 (המרכז הרפואי של אוניברסיטת מדינת אוהיו (OSUMC)) ולהכין מדיום הגידול להשלים (כלומר, גבוהה גלוקוז בינוני של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) המכיל 10% עוברית שור סרום (FBS), פירובט סודיום 1 מ"מ, 1% גלוטמין ו -1% סטרפטומיצין / פניצילין).
    הערה: על מנת לאפשר בין-ניסיוני שחזור טוב יותר, עדיף להשתמש בתאי C26 עם חלוף נמוך ככל האפשר.
  2. השתמש דלפק תא זמין מסחרי לצלחת 50,000 תאים / 2 סנטימטרים צלוחיות עם מדיום גידול להשלים. דגירה אותם באווירה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד ומחוברות משנה. הימנע culturing אותם בצפיפות גבוהה כדי קודםבידול נסחף אף אוזן גרון של פנוטיפים התא.
  3. לאחר המעבר הראשון, מספיק תאי צלחת השתלתו המספר המתוכנן של חיות. ביום ההשתלה התא, לנתק את התאים על ידי trypsinization עם 0.02 מ"ל של תמיסת 0.25% טריפסין-EDTA לס"מ 2, לנטרל את טריפסין על ידי הוספת לפחות 3 מ"ל של מדיום חדש לכל מ"ל של טריפסין, לקבוע ריכוז של תאים תאים / מ"ל , ו resuspend מספר התאים הדרושים לצורך הניסוי (1 x 10 6 תאים לכל עכבר) ב- PBS סטרילית.
    הערה: תאים C26 להגיע confluency כאשר הצפיפות היא כ -500,000 תאים / 2 ס"מ.

2. עכברים

  1. בחר באקראי עכברי CD2F1 מבוגרים (לפחות 8 שבועות של גיל) לקבוצות (בדרך כלל שולט גידול נושאי) עם לפחות n = 6 לכל קבוצה.
    הערה: גידולי C26 לגדול Balb / c עכברים גם כן. עם זאת, בהתבסס על הניסיון שלנו, עכברי CD2F1 מייצגים שורה צדדית וכלכלית יותר עבור דגם גידול המסוים הזה. יתר על כך,דומה להגדרות הקליניות לממצאים שדווחו דגמים ניסיוניים אחרים של שריר הסרטן קשור המבזבזים 14-16, הבדלים בין מיני תגובת תשישות C26 עשוי להיות גם ציינו 17 (ראה גם לוח 1).
  2. להרדים את העכבר באמצעות isoflurane משאיפת (3% חמצן). שמירה על בעלי החיים תחת הרדמה בלעדי את הזמן הדרוש כדי לבצע את חיסון הגידול. ודא עכבר שוכב על משטח לוהט על מנת למנוע אובדן חום הגוף. לפני שתתחיל בהליך הזרקת גידול, לאשר הרדמה תקינה על ידי צובט את בוהן האחוריות בעדינות.
    הערה: בשל משך הליך זה (בדרך כלל כמה שניות), שימוש עין משחה וטרינרים אינו נדרש. מאותה הסיבה, חיות בקרה שעברו את ניתוח הדמה אינן צפויות לרדת במשקל.
  3. באמצעות מזרק אינסולין 1 מ"ל סטרילי עם מחט 26-מד, להזריק במהירות 250 μl של פתרון המכיל את tumor תאים תת עורית ו intrascapularly ב כרית השומן של העכבר.
    הערה: חיות הבקרה תקבלנה 250 μl של תמיסת מלח סטרילית intrascapularly ב כרית השומן.
  4. מניח את גב החיה בכלוב שלה. ישירות להתבונן בעכבר לפחות פעם ב -15 דקות עד שהוא יכול להגיב מניפולציה עדינה יש שהעלה רפלקס ליישר.
    הערה: אל תשאיר את העכבר ללא השגחה, ולשמור אותו בכלוב התאוששות חם המכיל מצע מוצק. יתר על כן, לא להחזיר את העכבר לחדר החיה עד שהוא התאושש לחלוטין מן ההרדמה. באופן כללי, עכברים לא צריכים להיות מאוחסנים בנפרד אלא אם החוקר ומטרתו להעריך את צריכת מזון בודדת. אם זה מקרה ואת השימוש בכלובים מטבולית אוטומטיים אינו זמין, הקלטה ידנית של צריכת מזון חייבת להתבצע, ואולי יומית ובאותו הזמן בכל יום.
  5. בדוק את העכברים יומיים ולהקליט משקולות הגוף שלהם.
    הערה: הקלטת תוצאת מצב גוףהתנהגויות בכלוב בבית יכול להבדיל מעלות של התנהגות תשישות וחולי, אשר הוא שימושי עבור מחקרים טיפול 18.

3. המתת חסד וגביית הדם

  1. כאשר אובדן משקל גוף ב מארחי הגידול לעומת שולטת מגיע 5%, 10%, או 15% (קלה, בינונית, ו תשישות חמורה, בהתאמה) לעומת משקולות הגוף ההתחלתי שלהם, להרדים את העכברים.
    הערה: ניסוי טיפוסי יבוצע עד קבוצה אחת מגיעה הרזית 10%, שעליה זמן כל הקבוצות מומתות. הרזיה גוף נבחנת על ידי מדידת משקל הגוף כולל של הגידול.
  2. מניחים את העכבר תחת הרדמה כללית isoflurane (3% חמצן). להקיז דם באמצעות לנקב לב (כ 1 - 1.5 מ"ל).
  3. אסוף את דם K 2 -EDTA (מ"ג 18) צינורות ריקים ומניח אותם על קרח. צנטריפוגה הדם (2,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C) לאסוף את / סרום פלזמה.
  4. להרדים את העכבר באמצעות גנקע ervical. המשך כריתת רקמות אוסף איברים.

רקמות 4. כריתת איברים

הערה: לשימוש של רקמות מבחני ביולוגיה ביוכימי או מולקולריים, מתכננת לשקול כל איבר ורקמה ומקום שבר מייד לתוך cryotubes מראש שכותרתו. הצמד להקפיא בחנקן נוזלי חנות ב -80 ° C.

  1. על מנת למנוע זיהום של דגימות רקמה עם פרווה, לרסס אתנול 70% על כל הגוף.
  2. מניח את העכבר על מצע לנתיחה בעמדת פרקדן ולהרחיב איבר אנכי על ידי הצמדת רגליו אל מהדק buret גבוה.
  3. אחוז העור של גפיים התחתונים עם מלקחי דומון ולהשתמש מספריים בסדר המעוקלים כדי להסיר את העור ואת fascia בעדינות, חושף את בטן השריר הבסיסית של הגפיים התחתונים.
  4. זהה את שריר הסובך על אחורי גפיים תחתונים על ידי מקורו בבית condyles לרוחב המדיאלי על הירך האחורית והחדרתו בcalcaneus באמצעות גיד calcaneal.
    1. המשך לחתוך את גיד calcaneal הגסטרוקנמיוס. אחוז הקצה הדיסטלי של הגסטרוקנמיוס עם מלקחיים דומון ולמשוך את הבטן שרירים כלפי מקורו. בעזרת מספריים, לחתוך את השריר בראשית הצירים הקרובים ככל האפשר אל הירך. מניח את השריר בצלחת. לשקול את זה מיד ולהקפיא אותו צינור בחנקן נוזלי.
      הערה: הקפד לא שיחתוך את שריר הסוליה יחד עם הגסטרוקנמיוס. אם זה יקרה, להסיר soleus בקפידה על ידי משיכתו בעדינות את עם מלקחיים.
  5. המשך לזהות ולהסיר את השריר הקדמי tibialis מראשיתה על פני שטח anterolateral של הטיביה והחדרתו על היתדות המדיאלי באמצעות הגיד הדיסטלי שלה.
    1. על מנת לקבל מינוף, להחזיק את כף הרגל על ​​ידי לתפוס את הספרות עם האצבע המורה והאגודל. הכנס את קצה מלקחי דומון מייד תחת הגיד דיסטלי השטחי של tibialis ולעבור מלקחיים כך blצד unt ניתן להשתמש כדי לנתק את בטן שריר tibialis מרקמת החיבור הבסיסית.
    2. חותך את הגיד הדיסטלי באמצעות המספריים מעוקלים בסדר, ולאחר מכן לחתוך את השריר על המקור, קרוב ככל האפשר אל השוקה.
  6. פתח את חלל הבטן על ידי ביצוע חתך sagittal החל באזור hypogastric ומרגש superiorly לאזור ברום הבטן, לעצור את החתך מעל הסרעפת.
    הערה: עומק החתך צריך להיות מספיק רק לפרוץ את דופן הבטן השרירה ואת fascia הצפק הבסיסי.
  7. מוציא בזהירות את הכבד ידי אחיזה אותו עם המלקחיים שקצו הבוטים, ולהשתמש מספריים מעוקלים בסדר לנתח משם כל כלי דם או רקמת חיבור המצמידים את הכבד אל החלל. יש להיזהר שלא להשאיר שום אונות מאחורי. לשקול ולהצמיד להקפיא את הכבד בתוך שפופרת בחנקן נוזלי.
  8. באמצעות המלקחיים שקצותיהם הבוטים, להתרחק המעי, ולאחר מכן לחשוף ובעדינות להסירהטחול. אחוז הטחול בעדינות עם מלקחיים שקצהו בוטה ולהשתמש הגב או על הצד הקהה של במספריים מעוגלים בסדר לנתח משם כל כלי רקמת חיבור או דם דבקות הטחול אל חלל. לשקול ולהצמיד להקפיא אותו צינור בחנקן נוזלי.
  9. זהה את רפידות שומן אשכים, סומכים יותרת האשך (אצל גברים) או רחם (בנקבות). בעדינות לתפוס את כרית שומן epididymal עם המלקחיים שקצו הבוטים למשוך את הרקמות מתוך החלל. בעזרת המספריים מעוקלים בסדר, לחתוך את כל רקמת אשכים שעשויים להיות מחוברי כרית השומן. לשקול את כרית השומן ולהצמיד להקפיא אותו צינור בחנקן נוזלי.
    הערה: באופן כללי, רקמת שומן זה נחשב נציג של מסת השומן בגוף הכולל בעכברים וירידה במשקל עם תשישות. רפידות שומן אחרים ניתן לזהות באופן דומה, גזור, מוסר, ומשקלו.
  10. השתמש במספריים מעוגלים בסדר כדי לפתוח את החזה של החיה. לחתוך את הצלעות מצורפות בשני הגבולות לרוחב של sternum. הסר את עצם החזה. באמצעות שני זוגות מלקחיים, לתפוס כל צד של כלוב הצלעות ולמשוך בכל צד רוחבי כדי לפתוח את חלל בית החזה.
  11. בעדינות למשוך את הלב עם מלקחיים. בזהירות שיחתוך את הלב עם המספריים המעוקלים בסדר על ידי ניתוק אב העורקים אטריום השמאל. הקפד לרוקן את האיבר של כל דם שיורית ידי סופג אותו בעדינות נגד כמה נייר סופג. לשקול ולהצמיד להקפיא אותו צינור בחנקן נוזלי.

הקפאת שרירים 5. הרכבה

  1. לטבול את החצי התחתון של מבחנת פלסטיק קטנה (50 מיליליטר) המכילה איזופנטאן לתוך חנקן נוזלי. איזופנטאן מוכן לשימוש כאשר הוא הופך להיות צמיג מעט ויוצר רירי למינציה לבן מוצק הפנימית של הכוס (טמפרטורה: -160 מעלות צלזיוס).
    הערה: השתמש תמיד nonsparking ברונזה או אלומיניום כלי יד. הימנע נושם אדי מוצר. השתמש עם אוורור מתאים. אם התמודדות עם לשפוך ואוורור הוא בלתי אפשרי או impracticאל, ללבוש נשימה מתאימה.
  2. להקפיא כמה בינוני הטבעה על צ'אק (פקק) על ידי טבילה זה בקצרה (10 שניות) לתוך איזופנטאן.
  3. טפל השריר (למשל., את tibialis או הגסטרוקנמיוס) על ידי מחזיק אותו הגיד, אנכי ביחס הפקק, כדי לשמור על הכיוון של הסיבים ולאפשר עבור חתכים.
  4. בזהירות למקם את סוף החלק של השריר הטרי על גבי מדיום ההטבעה הקפוא.
    הערה: השריר ידבק. חשוב לא להקיף את השריר לחלוטין עם ההטבעה בינונית. כמו כן, חשוב לשמור על הכיוון האנכי לקביעה הבאה של החתך באזור.
  5. טובל את צ'אק עם השריר המחובר לאמבטית איזופנטאן (בפעם ההקפאה הרגילה היא 7 - 15 שניות, תלוי בגודל הדגימה ורכב).
    הערה: טבילה בתמיסת ההקפאה לא צריכה להימשך יותר מ נדרש להקפיא את הדגימה לחלוטין. הקפאת frac יהיה ארוך מדיture לחסום רקמות, תוך זמן קצר מדי יגרום להיווצרות קרח קריסטל. טיפוס היטב קפוא יהיה לבן גירים.
  6. לאחר הקפאת הדגימה, ולמקם אותו לתוך שקית ניילון קטנה או צינור הדגימה (50 מ"ל) ומיד ולאחסן אותו במקפיא עמוק ב -80 מעלות צלזיוס או בחנקן נוזלי.

6. ניתוח של הנתונים הגולמיים

  1. על מנת לשלוט על שונה מבחינת גודל של העכברים, לנרמל את משקל הגוף הסופי (FBW); גידול ללא משקל גוף; ו פגר, איברים, רקמות ומשקל (הביע בגרמים) בהתאם למשקל הגוף ההתחלתי (IBW), ולבטא אותם כמו "משקל / 100 מ"ג IBW".
    הערה: לחילופין, ישנם חוקרים לנרמל את מסת השריר לאורך השוקה.
  2. השתמש תוכנה לניתוח נתונים. מצא את הממוצע ואת SD של המשקולות המנורמלות. בביצוע ניתוחים סטטיסטיים עם מבחני t של סטודנט מזווג בין הבקרות C26 נושאות עכברים.
    הערה: תוצאות ניתן להציג ביחס לגוף (IBW ו-חינם גידול FBW), גידול, איבר, ומשקולות רקמות.

7. שרירים חתך

  1. הגדר את טמפרטורת העבודה של החדר הפנימי cryostat לסביבות -23 מעלות צלזיוס.
  2. אפשר הדגימה (נשמרו קודם ב -80 ° C) להתאקלם בבית טמפרטורת עבודה (כמה שעות צריך להיות מספיק).
  3. Cut מספר חלקים עבים 8-מיקרומטר של הדגימה (רצוי הקדמי tibialis או השרירים הגסטרוקנמיוס) ולאסוף אותם בשקופיות זכוכית.
    הערה: חותך את הסעיף ב באזור אמצע הבטן של השריר. כמו כן, למען הדיוק, לחתוך את החלקים בניצב לציר הגובר.
  4. שמור את שקופיות זכוכית בפנים הקאמרית cryostat. אל תתנו להם להפשיר אם המטרה היא לבצע IF / מחקרים IHC או מכתים האנזימטית.
  5. אחסן את השקופיות ב -80 מעלות צלזיוס במשך ניתוחים נוספים.

8. הערכת גודל Myofiber ידי Laminin Immunofluorescence (חלופה 1)

s = "jove_content"> הערה: לצורך ההערכה של מורפולוגיה שרירים חתך באזור (CSA), hematoxylin ו eosin (H & E) - כמו גם immunofluorescence (IF) שיטות מכתימות מבוססות מתקבלות מערכות כדי לקבוע גודל סיבים 19. למרות צביעת H & E סעיפי שריר מייצג שיטת ערך והנוחה עבור הניתוח של מורפולוגיה, השימוש בגישת IF 14 הוא מהיר בצורה משמעותית ובצניעות יותר מדויק מאשר בשיטה המבוססת E H &. שיטות H & E מתוארות להלן.

  1. הסר קטעי רקמה מאחד את cryostat או אחסון -80 מעלות צלזיוס ולאפשר להם לאזן לטמפרטורת החדר (כ 5 - 10 דק ').
    הערה: על מנת להימנע אינטראקציות שאינן ספציפיות הקשורות נוגדנים ראשוניים העלו בעכברים, רצויה גם נוגדני שימוש וגדל מין אחר או לעשות שימוש זמינה מסחרי "עכבר על-עכבר" ערכות immunodetection.
  2. לטבול את הסעיפים-מגניב מראשמתנול ed (-20 מעלות צלזיוס) במשך 10 דקות.
  3. לשטוף את הסעיפים בטמפרטורת החדר 1x PBS במשך 5 דקות.
  4. הסר את PBS ולהשתמש עט עבור יישומים immunohistochemical להקיף את הסעיפים בשקופית. אל תתנו סעיפים יבשים לחלוטין בכל נקודה.
  5. למרוח למאגר חסימה מתאים (5 - 8% FBS ב PBS או 5% סרום עיזים ב PBS) על החלקים עבור שעה 1 ב RT.
  6. הסר את חוצץ החסימה.
  7. החל גם אנטי laminin ארנב (1:30) או אנטי-בדיסטרופין העכבר (1:30) נוגדן ראשוני בחסימת המאגר בסעיפים עבור שעה 2 ב RT (או לילה ב 4 ° C) בתא לח.
  8. שטפו את החלקים עם 1x PBS במשך 5 דקות.
  9. הסר את החיץ לשטוף ולשטוף סעיפים שוב 1x PBS במשך 5 דקות.
  10. הסר את חיץ לשטוף ולהחיל נוגדנים משני פלורסנט ראויה (1: 1,000 בחסימת המאגר) בסעיפים בתא לח במשך שעה 1 ב RT.
  11. הסר את הנוגדנים משני ולשטוף את החלקים עם 1x PBS במשך 5דקות.
  12. הסר את החיץ לשטוף וחזור על לשטוף עם 1x PBS במשך 5 דקות. הסר את החיץ לשטוף ולכסות את החלקים עם כוס כיסוי באמצעות בתווך מימים מבוססים.
  13. זהה את תכונות מורפולוגיות של השריר באמצעות תמונות דיגיטליות של הסעיף המוכתם. כדי לעשות זאת, משתמש במיקרוסקופ אור פלואורסצנטי הפוכה עבור סעיפי IF (מטרה בהגדלת 10X או 20X מתאימה), יחד עם תוכנה ללכידת מצלמת תמונה דיגיטלית. מניח סרגל קנה מידה בכל תמונה דיגיטלית (20 - 30 שדות אקראיים מומלצים לכל קטע שריר) כדי להקל על כימות של CSA. התמונה צריכה להיות נשמר בפורמט .TIF להיות תואם עם תוכנת ניתוח התמונה באמצעות תוכנית ImageJ.
  14. השתמש מאקרו ImageJ להבחין רקמת חיבור מרקמות התכווצות (גודל myofiber) באמצעות נוכחותם של נוגדנים משני ניאון endomysium 20.
    הערה: מאקרו וההוראות זמינים authORS, ריצ'רד ליבר ושינון ברימנר.
  15. פתח את התוכנית ImageJ ידי לחיצה כפולה על סמל בשולחן העבודה.
  16. טען את המאקרו CSA על ידי לחיצה אחת על הכרטיסייה "תוספים". מזיז את הסמן למטה כדי לבחור באפשרות "Install" על ידי לחיצה על זה פעם.
  17. טען את המאקרו חתך ידי בחירתו מהתיקייה זה נשמר ב, ולאחר מכן לחץ על "פתח".
  18. לאחר מאקרו נפתח, פתח את התמונה היסטולוגית המכיל את סרגל קנה המידה על ידי לחיצה על "קובץ" ולאחר מכן "פתח" מסרגל הכלים ImageJ.
  19. לאחר התמונה נפתחת, בחר את "כלי קו הישרים" בתכנית ImageJ על ידי לחיצה על הסמל עם הקו הישר.
  20. לאחר "כלי קו הישרים" מסומנים, לחץ פעם אחת על הקצה השמאלי ביותר של סרגל קנה המידה ולאחר מכן לחץ פעם אחת על העכבר הימני ביותר בקצה בר המידה. כאשר נעשה בצורה נכונה, לא צריך להיות קו צהוב מעולף על סרגל קנה המידה.
  21. וודא כי Yelloקו w עדיין מעולף על סרגל קנה מידה, בחר את הכרטיסייה "לנתח" מסרגל הכלים ImageJ ידי לחיצה עליו פעם.
  22. בלשונית "לנתח", להזיז את הסמן מטה ובחר "סולם להגדיר" על ידי לחיצה על זה פעם.
  23. בחלון "קבע סולם", אל תשנה את הערך "המרחק בפיקסלים" תיבה. הזן את המרחק הידוע של סרגל קנה המידה בתיבה "המרחק מוכר". שנה את היחידות בתיבת "יחידת האורך" להתכתב עם יחידות סרגל קנה המידה (כלומר, מיקרומטרים = מיקרומטר). לבסוף, בחר "גלובלי" על ידי לחיצה על התיבה שמשמאל של "גלובל" פעם.
  24. סגור את החלון "קבע סולם".
  25. פתחו את התמונה הראשונה כדי להימדד על ידי לחיצה על הכפתור "O" על המקלדת. שים מוקפץ חלון המאפשר למשתמש למצוא ובחר את התמונה כדי להימדד מהתיקייה זה נשמר ב. בחר את התמונה על ידי לחיצה על זה פעם אחת ואז לחיצה על "פתח".
  26. לאחר הפתיחה, חלון אמור להופיע לבחירת הטווח המקובל למדידות CSA ועבור המעגליות.
    הערה: הגדרות אלו נותרות בדרך כלל לערכי ברירת המחדל שלהם. עם זאת, אם אדם רוצה לשנות הגדרות אלה, כדי להיות בטוחים כדי לשמור על הערכים זהים עבור כל תמונה ברציפות להימדד הניסוי.
  27. לאחר קביעת הטווח מעגלי CSA, להתבונן בתמונה המכוסית בפיקסלים אדום עם חלון "סף". התאם את הסף של התמונה באמצעות הסורגים בחלון "סף" עד סיבי השריר מולאו באופן מדויק עם פיקסלים אדומים.
    הערה: לנסות להשיג את המספר הגדול ביותר של סיבים שאינם נוגעים זה בזה; אם הסיבים הם נוגעים, הם יימדדו כמו סיב אחד גדול, אשר יהיה צורך לערוך במורד הזרם.
  28. לאחר קביעת הסף, לחץ על הכפתור "1" במקלדת כדי למדוד את סיבי השריר.
  29. הקף את סיבי השריר הפרט עם קו צהוב.העבר דרך התמונה ולהסיר חפצים או סיבים כפולים אשר נבחרו על ידי התכנית. כדי לעשות זאת, בחר המבנים שאינם סיבי-ידי לחיצה עליהם פעם אחת, ולאחר מכן ללחוץ על כפתור "D" במקלדת. פעולה זו תמחק אותם מן המדידות.
  30. לבחור ולהעתיק את המידות מן "חלון ערך מדידה," ולהדביק אותם לתוך גיליון אלקטרוני לניתוח נוסף.
    הערה: הערכים המתקבלים יכולים לשמש גם כדי להעריך את ניתוח התפלגות סיבים, אשר בדרך כלל מייצג פרמטר שימושי כדי לקבוע אם צמיחת גידול קדם שינוי בכיוון סיבי שריר קטן.
  31. סגור את כל החלונות הפתוחים ImageJ על ידי לחיצה על "X" בפינה השמאלית-עליונה של חלונות.
  32. פתח תמונה חדשה כדי להימדד על ידי לחיצה על "O" ו חזרה על שלבים 8.24 - 8.29.

הערכת 9. גודל Myofiber מ H & E מוכתם סעיפים (חלופה 2)

  1. מניחים את הכוסמגלשות לצנצנות Coplin המכיל מסוננים hematoxylin האריס במשך 8 דקות.
    הערה: לחלופין, hematoxylin המאייר יכול לשמש אם כתם אינטנסיבי פחות הוא רצוי.
  2. יש לשטוף את השקופיות במים deionized.
  3. טובלים את השקופיות במי ברז עד 5 דקות.
  4. במהירות לשטוף אותם במים ללא יונים, ולאחר מכן לדגור אותם בתמיסת 1% eosin מסונן עבור פחות מ -2 דקות.
    הערה: אם כתם אינטנסיבי יותר הוא רצוי, להוסיף 1 - 2 טיפות של חומצה אצטית (0.01% או פחות) לפתרון eosin.
  5. להתחיל את צעדי ההתייבשות. יש לשטוף את השקופיות אתנול 70% בפחות מ 1 דקות.
  6. טובלים את השקופיות אתנול 90% דקות 1.
  7. טובלים את השקופיות אתנול 95% דקות 1.
  8. טובלים את השקופיות אתנול 100% למשך 2 דקות.
  9. טובלים את השקופיות קסילן במשך 2 דקות. להעביר שקופיות למשנהו צנצנת קופלי המכיל קסילן טרי למשך 2 דקות יותר.
    הערה: שמור את השקופיות קסילן (לא יותר מ 1 hr) עד שהם coverslipped.
  10. מניחים את coverslips על הסעיפים השרירים באמצעות Permount או מדיום של בחירת הרכבה מבוססת קסילן.
  11. שימו לב שקופיות הזכוכית הצבעונית E H & תחת מיקרוסקופ עם הגדלה 20X, ולרכוש תמונות של האזור סעיף השריר כולו. להשיג תמונות באמצעות מיקרוסקופ בהיר-אור, מצלמה דיגיטלית, תוכנה ללכידת תמונה.
    הערה: הנוכחות של סרגל קנה מידה או תמונה של מיקרומטר נלקחה ב ההגדלה אותו תידרש לקבוע את CSA. כנ"ל, להקליט לפחות 20 - 30 שדות אקראיים עבור כל מקטע שריר.
  12. להעריך את גודל myofiber באמצעות תוכנת ImageJ. פתוח כל תמונה דיגיטלית. הגדר את קנה המידה כאמור לעיל. מדוד לפחות 1,500-2,000 סיבי שריר לכל שריר באמצעות כלי בחירה ביד החופשית, התחקות היקף הסיבים עם עכבר או עבור קלט מהר, עם מכשיר קלט של Tablet ועט.

איסוף נתונים 10. וניתוח

  1. כדי להקים גודל סיבי שריר, להעריך את שטח סיב "הממוצע."חשב אמצעי SD עבור המדידות המתקבלות עבור כל שריר, כולל הוא את האזור בקוטר של Feret. בנוסף, על מנת להעריך האם הגדרת הניסוי קשורה שינוי בכיוון קטן או גדול סיבי שריר, לנתח את" חלוקת הסיבים . "
  2. להעריך את המשמעות של התוצאה על ידי ביצוע מבחן t מזווג עבור שתי קבוצות. לקבוע את היחס בין הערכים שהתקבלו עבור קבוצת עכברי C26 ועבור קבוצת הביקורת. מגרש את הערכים על גרף דיווח SD האמצעים ואת היסטוגרמה התדירה ההפצה / שנועדה להפגין את המשמרת בגדלי סיבים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

קינטיקה צמיחת גידול C26 להראות שלב בפיגור עבור 7 הראשון - ד 8 לאחר הזרקה, ואחריו צמיחת תאי מעריכים (4 - 5 ד). המסה של הגידול מגיע בסופו של דבר ~ 10% ממשקל הגוף (כ -2 גרם; איור 1 א-ב). במהלך השלב הראשון, הגידול יכול להיות ממוקם על ידי מישוש בלבד ומופיע כמו בליטה קטנה של העור. בשלב השני, הגידול הוא ציין כגוש מתחת לעור. לעיתים נדיר, הגידול הופך כיבים, וכתוצאה מכך פצע פתוח; במקרה זה, העכבר הוא נכלל בקבוצת הניסוי והוא מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במיוחד בשלבים האחרונים שלה, סרטן המעי הגס הוא קשור להתפתחות של תשישות, האחראית על תוצאות פחות טובות וירידה באיכות חיי המטופל. מחקרים רבים התמקדו בטיפול תנאים משני לסרטן; עם זאת, למרות מאמצים רבים בכיוון זה, עדיין אין טיפול מאושר תשישות סרטן 21. לפיכך, קיים הכרח כי במודלים של בעלי חיים דומים הפתולוגיה האנושית ככל האפשר על מנת למקסם את התרגום של הממצאים.

עכברי גידול נושאות C26 הם מודל ניסיוני נפוץ של תשי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לריצ'רד ליבר ושאנון ברמנר על המאקרו וההוראות של ImageJ. בזמן לימודיו באוניברסיטת תומאס ג'פרסון, עבודה זו נתמכה על ידי מענק CURE של משרד הבריאות של פנסילבניה TJU מס' 080-37038-AI0801. לאחר מכן, מחקר זה נתמך על ידי מענק ל-AB מהמכונים הלאומיים לבריאות (R21CA190028), ועל ידי מענקים ל-TAZ מהמכונים הלאומיים לבריאות (R01CA122596, R01CA194593), מרכז הסרטן IU Simon, קרן לוסטגרטן, קרן לילי בע"מ ומרכז חתימת הלבלב של IUPUI.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תרבית תאים צלוחיותבז - בקטון דיקינסון35-5001
DMEMCellgro10-017-CV
FBSGibco26140
סטרפטומיצין-פניצילין Cellgro30-002-CI
CD2F1 עכבריHarlan060
מכשיר הרדמהEZ-AnesthesiaEZ-7000
2-מתיל בוטאןסיגמא-אולדריץ'M32631
OCTTissue-Tek4583
CryostatLeicaCM1850
דיסקי פקקמיקרוסקופ אלקטרונים Sciences63305
Superfrost plus זכוכית שקופיותVWR48311-703
נוגדן פוליקלונלי ארנב אנטי למיניןSigma-AldrichL9393
נוגדן חד שבטי נגד דיסטרופיןמעבדות וקטורVP-D508
קמח אלקסה 594 נגד עכבר IgGLife TechnologiesA11062
קמח אלקסה 594 אנטי ארנב IgGLife TechnologiesA21211
המטוקסיליןסיגמא-אולדריץ'GHS216
אאוזיןסיגמא-אולדריץ'HT110332
קסילןאקרוס אורגני422680025
ציטוסיל-XYLתרמו8312-4
מיקרוסקופZeissObserver.Z1 
טאבלט במבוקWacomCTH-661
Prism 7.0 עבור Mac OS XGraphPad Software, Inc.
Excel for Mac 2011Microsoft Corp.
ImageJהמכונים הלאומיים לבריאות בארה"IJ1.46
http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html MicrotainerBD365873
ב

מקורות

  1. Tan, B., Fearon, K. Cachexia: prevalence and impact in medicine. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 11, 400-407 (2008).
  2. Aulino, P., et al. Molecular cellular and physiological characterization of the cancer cachexia-inducing C26 colon carcinoma in mouse. BMC cancer. 10, 363(2010).
  3. Bonetto, A., et al. STAT3 activation in skeletal muscle links muscle wasting and the acute phase response in cancer cachexia. PloS One. 6, e22538(2011).
  4. Bonetto, A., et al. JAK/STAT3 pathway inhibition blocks skeletal muscle wasting downstream of IL-6 and in experimental cancer cachexia. Am J Physiol Endocrinol Metab. 303, E410-E421 (2012).
  5. Bonetto, A., et al. Deacetylase inhibitors modulate the myostatin/follistatin axis without improving cachexia in tumor-bearing mice. Current Cancer Drug Targets. 9, 608-616 (2009).
  6. Acharyya, S., et al. Cancer cachexia is regulated by selective targeting of skeletal muscle gene products. The Journal of Clinical Investigation. 114, 370-378 (2004).
  7. Fearon, K., et al. Definition and classification of cancer cachexia: an international consensus. The Lancet Oncology. 12, 489-495 (2011).
  8. Holecek, M. Muscle wasting in animal models of severe illness. Int J Exp Pathol. 93, 157-171 (2012).
  9. Acharyya, S., et al. Dystrophin glycoprotein complex dysfunction: a regulatory link between muscular dystrophy and cancer cachexia. Cancer Cell. 8, 421-432 (2005).
  10. Benny Klimek,, E, M., et al. Acute inhibition of myostatin-family proteins preserves skeletal muscle in mouse models of cancer cachexia. Biochemical and Biophysical Research Communications. 391, 1548-1554 (2010).
  11. Pedroso, F. E., et al. Inflammation, organomegaly, and muscle wasting despite hyperphagia in a mouse model of burn cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 3, 199-211 (2012).
  12. Soda, K., Kawakami, M., Kashii, A., Miyata, M. Manifestations of cancer cachexia induced by colon 26 adenocarcinoma are not fully ascribable to interleukin-6. International journal of cancer. 62, 332-336 (1995).
  13. Costelli, P., et al. IGF-1 is downregulated in experimental cancer cachexia. American journal of physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 291, R674-R683 (2006).
  14. Palus, S., Akashi, Y., von Haehling, S., Anker, S. D., Springer, J. The influence of age and sex on disease development in a novel animal model of cardiac cachexia. International Journal of Cardiology. 133, 388-393 (2009).
  15. Norman, K., et al. Effect of sexual dimorphism on muscle strength in cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 3, 111-116 (2012).
  16. Stephens, N. A., et al. Sexual dimorphism modulates the impact of cancer cachexia on lower limb muscle mass and function. Clinical Nutrition. 31, 499-505 (2012).
  17. Cosper, P. F., Leinwand, L. A. Cancer causes cardiac atrophy and autophagy in a sexually dimorphic manner. Cancer Research. 71, 1710-1720 (2011).
  18. Ullman-Cullere, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49, 319-323 (1999).
  19. Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Rep. 4, 732(2015).
  20. Minamoto, V. B., et al. Increased efficacy and decreased systemic-effects of botulinum toxin A injection after active or passive muscle manipulation. Dev Med Child Neurol. 49, 907-914 (2007).
  21. Murphy, K., Lynch, G. Update on emerging drugs for cancer cachexia. Expert Opin Emerg Drugs. 14, 619-632 (2009).
  22. Seto, D. N., Kandarian, S. C., Jackman, R. W. A Key Role for Leukemia Inhibitory Factor in C26 Cancer Cachexia. The Journal of Biological Chemistry. 290, 19976-19986 (2015).
  23. Judge, S. M., et al. Genome-wide identification of FoxO-dependent gene networks in skeletal muscle during C26 cancer cachexia. BMC Cancer. 14, 997(2014).
  24. Kliewer, K. L., et al. Adipose tissue lipolysis and energy metabolism in early cancer cachexia in mice. Cancer Biol Ther. 16, 886-897 (2015).
  25. Aversa, Z., et al. Changes in myostatin signaling in non-weight-losing cancer patients. Ann Surg Oncol. 19, 1350-1356 (2012).
  26. Bonetto, A., et al. Early changes of muscle insulin-like growth factor-1 and myostatin gene expression in gastric cancer patients. Muscle Nerve. 48, 387-392 (2013).
  27. Lazarus, D. D., et al. A new model of cancer cachexia: contribution of the ubiquitin-proteasome pathway. The American Journal of Physiology. 277, E332-E341 (1999).
  28. al-Majid, S., McCarthy, D. O. Resistance exercise training attenuates wasting of the extensor digitorum longus muscle in mice bearing the colon-26 adenocarcinoma. Biol Res Nurs. 2, 155-166 (2001).
  29. Bonetto, A., et al. JAK/STAT3 pathway inhibition blocks skeletal muscle wasting downstream of IL-6 and in experimental cancer cachexia. American journal of physiology. Endocrinology and metabolism 303. 303, E410-E421 (2012).
  30. Samuels, S. E., et al. Liver protein synthesis stays elevated after chemotherapy in tumour-bearing mice. Cancer Lett. 239, 78-83 (2006).
  31. Cornwell, E. W., Mirbod, A., Wu, C. L., Kandarian, S. C., Jackman, R. W. C26 cancer-induced muscle wasting is IKKbeta-dependent and NF-kappaB-independent. PloS One. 9, e87776(2014).
  32. Penna, F., et al. Muscle wasting and impaired myogenesis in tumor bearing mice are prevented by ERK inhibition. PloS One. 5, e13604(2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

קרצינומה C26בזבז שריריםצמיחת גידולירידה במשקל הגוףשריר שלדרקמה שומניתרמות IL-6סיב שרירכריתת רקמה
קולון-26 קרצינומה גידול נושאות עכבר כמודל לחקר סרטן תשישות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.