Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение и расширение для взрослых собачьего гиппокампа Neural прекурсорах

7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54953

⸱

29 ноября 2016 г.

 ,  ,  , 
1Regenerative Neuroscience Group, University of Sydney, 2Wellcome Trust Centre for Neuroimaging, Institute of Neurology, University College London

В этой статье

Краткое содержание

Собачий мозг является ценным модель, в которой для изучения нейрогенез. Здесь представлены протоколы для выделения и расширения взрослых собачьих клеток гиппокампа нервные прекурсоров из первичной ткани головного мозга.

Аннотация

Было показано, что скорость нейрогенеза в гиппокампе взрослого человека варьируется у разных видов млекопитающих. Таким образом, собачий гиппокамп, демонстрирующий структурное посредничество между грызуном и человеческим гиппокампом, является ценной моделью для изучения нейрогенеза взрослого человека. Анализы культур in vitro являются важным компонентом характеристики нейрогенеза и взрослых нервных клеток-предшественников, позволяя точно контролировать клеточную среду. Однако на сегодняшний день протоколы культивирования клеток собак остаются недостаточно представленными в литературе. Здесь подробно описаны систематические протоколы выделения и культивирования нервных клеток-предшественников гиппокампа из мозга взрослой собаки. Мы демонстрируем экспансию собачьих нервных клеток-предшественников в виде плавающих нейросфер и в виде адгезивной монослойной культуры, производящей стабильные клеточные линии, способные дифференцироваться в зрелые типы нервных клеток in vitro. Нейронные предшественники взрослых собак являются недостаточно используемым ресурсом, который может обеспечить более точный аналог для изучения нейронных предшественников человека и клеточных механизмов взрослого нейрогенеза.

Введение

Региональные вариации скорости нейрогенеза наблюдались вдоль дорсовентральной оси гиппокампа грызунов1,2. Кроме того, темпы нейрогенеза гиппокампа также демонстрируют отчетливую межвидовую изменчивость, при этом показано, что оборот клеток-предшественников в субгранулярной зоне значительно ниже у взрослых людей, чем у грызунов3-5. Здесь могут иметь значение межвидовые различия в структурной анатомии гиппокампа, поскольку было постулировано, что распределение нейральных стволовых клеток вдоль нейроксиса желудочков мышей может зависеть от изгибов головы во время эмбриологическогоразвития. На сегодняшний день мозг грызунов остается самой популярной системой для изучения нейрогенеза взрослого человека. Тем не менее, мозг домашней собаки (Canis familiaris) с размером и структурнойорганизацией, промежуточной между человеческим и грызуном, представляет собой ценную, но крайне малоиспользуемую животную модель. Собачий гиппокамп, в частности, воплощает эту структурно промежуточную природу8-10 и может предоставить уникальный взгляд на внутренние вариации в популяциях нейральных клеток-предшественников. Имея много более близких параллелей с человеческим мозгом, собачья модель может также дать представление о биологии нейрогенеза взрослого человека.

Анализы культур in vitro стали ключевым инструментом для изучения нейронных предшественников, а также клеточных и биомолекулярных процессов взрослого нейрогенеза. Анализ нейросферы и адгезивная монослойная культура представляют собой две преобладающие системы для экспансии нейронных клеток-предшественников in vitro11-13. Протоколы экстракции мозга, микродиссекции гиппокампа или анализа культуры нейронных предшественников были хорошо задокументированы для моделигрызунов 14-16. Тем не менее, для мозга взрослой собаки они остаются сравнительно незначительными17,18, вместо этого сосредоточенными на плоде или неонатальной ткани19-21.

В нашем опубликованном исследовании7 мы исследовали региональные вариации нейрогенеза и популяций нейральных клеток-предшественников по дорсовентральной оси гиппокампа взрослой собаки. Несмотря на сильную зависимость от породы, зрелость у собак наступает в возрасте от 1 до 3 лет. Здесь мы подробно представляем методы экстракции, выделения и культивирования нейральных клеток-предшественников из гиппокампа собаки. Мы приводим систематические протоколы для экспансии нейральных клеток-предшественников как в виде плавающих нейросфер, так и в качестве адгезивной монослойной культуры, а также для их последующей дифференцировки в зрелые типы нейронных клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

В соответствии с Новый Южный Уэльс, Австралия закона, сообщение ткани патологоанатомическое мозг был приобретен у взрослых собак эвтаназии по причинам , не связанным с изучением.

1. Приготовление культуральной среды

  1. Готовят 0,1% раствор желатина добавлением 0,1 г желатина порошка в 100 мл дистиллированной воды и перемешивание при 37 ° С до растворения. Стерилизацию раствора с помощью УФ-облучения в течение 15 мин. Этот носитель затем можно хранить при температуре 4 ° С в течение до 1 месяца.
  2. Приготовьте соотношении 3: 1 из среды Игла в модификации Дульбекко (DMEM) и питательной смеси F12 путем добавления 167 мл F-12 до 500 мл DMEM (4,5 г / л D-глюкозы). Добавить 6,7 мл раствора пенициллин / стрептомицин (для конечной концентрации 1%). Эти носители могут быть сохранены в темноте при 4 ° С в течение до 1 месяца.
  3. Приготовьте 500 мл сыворотки сред путем объединения 440 мл DMEM (4,5 г / л D-глюкозы), 5 мл L-аланил-L-глутамин-дипептид (200 мМ), 5 мл пенициллина / стрептомицина и 50 мл фетальной Бовине сыворотки (ФБС). Эти носители могут быть сохранены в темноте при 4 ° С в течение до 1 месяца.
  4. Полная среда роста состоит из нейрональных стволовых Cell (НСК) базальной среды и пролиферации нейронные Дополнение-А (NS-А), 2% FBS, 2 мкг / мл гепарина, 20 нг / мл эпидермального фактора роста (ЭФР) и 10 нг / мл основной фактор роста фибробластов (bFGF). Сделать этот носитель свежий, непосредственно перед вскрытием мозга, и нагревают до 37 ° С в водяной бане.

2. Мозг Добыча

  1. Начать добычу в течение 6 ч после вскрытия путем стерилизации спинной поверхности головы собаки с использованием повидон-йод.
  2. Используя скальпель, сделайте продольный разрез вдоль сагиттальной средней линии, по всей спинной поверхности черепа, чтобы разоблачить основные мышцы массетерной. Длина этого разреза будет зависеть от вида и возраста собаки.
  3. В ростральной и каудальной границы черепе, сделать дополнительные 5 - 10 см, перпендикулярные разрезы с обеих сторон, проходятИНГ позади глаз и ушей соответственно, позволяют коже быть в полной мере отражены.
  4. Используя скальпель, отделяют жевательные мышцы от их прикрепления к сагиттальной гребень черепа и скрести все оставшиеся соединительной ткани из черепной коробки.
  5. Использование колебательный кости распиливания крышку черепа в окружной линии. С помощью зонда или скальпель разорвать любые оставшиеся вложения с ТМО, а затем осторожно снимите крышку черепа, чтобы выставить спинной поверхности мозга.
    Внимание: Толщина кости варьирует в различных регионах в черепе, поэтому необходимо соблюдать осторожность , чтобы не проникать слишком глубоко и повредить основной мозг.
  6. Отрежьте спинной мозг, вставив скальпель между верхних шейных позвонков.
  7. С одной стороны, осторожно поднимите мозг, использовать скальпель, чтобы аккуратно освободить мозг от черепной ямки и разъединить соединительные нервы и кровеносные сосуды, расположенные на вентральной стороне. Аккуратно поднимите бдождь из черепа и в контейнер ДЗФР.
    Внимание: Большие обонятельные луковицы собачьего мозга может проходить глубоко в передней черепной ямки. Необходимо соблюдать осторожность при удалении мозг так, чтобы сохранить эти структуры.

3. гиппокампа Вскрытие

  1. Промыть мозг в фосфатно-буферном солевом растворе Дульбекко (DPBS), чтобы удалить кровь, и поместите его спинной стороной вниз на 150 мм чашках Петри.
  2. Медленно рассекают мозг в продольном направлении через середину сагиттальной плоскости используя влажный нож мозга и единственный кусок, который использует всю длину лезвия. Не применять дополнительное понижательное давление, или использовать движение распиливания, так как это может привести к повреждению тканей.
  3. Размещение каждое полушарие медиальной поверхности вверх, рассекают из гиппокамп с помощью скальпеля и тонких щипцов, и перенести его на 35 мм блюдо культуры ткани в.

4. Выделение нейронных клеток-предшественников

  1. Фарш тОбразцы вопросу , используя лезвие скальпеля в приблизительно 1 мм 3 шт.
  2. Передача ткани в 15 мл пробирку, добавляют 2 мл 0,1% трипсина ЭДТА, и инкубируют в течение 7 мин на водяной бане при 37 ° С.
  3. Остановить ферментативную реакцию добавлением 4 мл сыворотки носителя в трубке. Гранул суспензии путем центрифугирования при 100 мкг в течение 7 мин и удалить супернатант.
  4. Ресуспендируют осадок в 300 мкл ДЗФР, и механически диссоциированы осторожно пипеткой вверх и вниз, используя 1000 мкл пипетки, пока гладкие формы гомогенатов.
  5. Добавьте 14 мл сыворотки носителя в пробирку и проходят клеточной суспензии через сито 40 клеток мкм. Гранул суспензии путем центрифугирования при 100 х г в течение 7 мин, удалить супернатант, и ресуспендируют в полной среде роста.

5. нейросфера Культура

  1. Из полученной клеточной суспензии в изоляции, подсчитать количество жизнеспособных клеток с использованием исключения трипанового синего красителя и гемоцитометре.
  2. Развести суспензии клеток в полной среде роста и семян в количестве 1 × 10 5 клеток / см 2 в непокрытые лунки 6 - луночного планшета с.
  3. Инкубировать при 37 ° C, 5% CO 2 и> 95% влажности в течение 14 - 28 дней, заменить 50% из питательной среды каждые 7 дней. Регулярно измеряйте диаметр нейросферах. Если позволено выйти за пределы 100 мкм в диаметре, гибель клеток и спонтанной дифференцировки может происходить в пределах нейросферах.

6. нейросфера Прохождение

  1. Для прохождения в качестве плавучего культуры, когда нейросферы достигает примерно 100 мкм в диаметре, объединить все нейросфера, содержащий носитель в одну пробирку. Гранул путем центрифугирования при 100 мкг в течение 7 мин и удалить супернатант.
  2. Ресуспендируют осадок в 1 мл 0,1% трипсина ЭДТА и инкубировать в течение 7 мин на водяной бане при 37 ° С. Аккуратно пипеткой вверх и вниз 100 раз, используя 200 мкл пипетки, чтобы обеспечить dissociatiна из нейросферах.
  3. Прекратить ферментативной реакции путем добавления 5 мл сыворотки носителя в пробирку и центрифугируют при 100 х г в течение 7 мин.
  4. Удалить супернатант, ресуспендируют осадок клеток в 1 мл полной среды роста и подсчитывают количество жизнеспособных клеток с использованием исключения синий краситель трипанового и гемоцитометра.
  5. Развести суспензии клеток в полной среде роста и семян в количестве 1 × 10 5 клеток / см 2 в непокрытые лунки 6 - луночного планшета с. Инкубировать при 37 ° C, 5% CO 2 и> 95% влажности в течение 14 - 28 дней, заменяя 50% из питательной среды каждые 7 дней.

7. Приверженец культура Neural клеток-предшественников

  1. Добавьте достаточный объем 0,1% раствора желатина, чтобы покрыть поверхность тканевой культуры, тарелкой и отверждения в термостате при температуре 37 ° С в течение 1 ч до обработки нейросферы для культуры прикрепленных.
  2. С плавающей нейросфера культуры, объединить все средства массовой информации в одну трубу. Гранул Neurospheres центрифугированием при 100 мкг в течение 7 мин и удаляют супернатант.
  3. Ресуспендируют осадок в 1 мл 0,1% трипсина ЭДТА и инкубировать в течение 7 мин на водяной бане при 37 ° С. Аккуратно пипеткой вверх и вниз 100 раз, используя 200 мкл кончиком пипетки.
  4. Добавьте 5 мл сыворотки СМИ, чтобы остановить реакцию фермента и центрифуге при 100 мкг в течение 7 мин. Жидкость над осадком сливают и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл полной среды роста и подсчитывают количество жизнеспособных клеток с использованием исключения синий краситель трипанового и гемоцитометра.
  5. Развести суспензии клеток в полной среде роста, удалить желатин из колб культуры тканей и семян клеток при 1 × 10 4 клеток / см 2.
  6. Инкубируйте клетки при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 и> 95% влажности. Замените носитель со свежими, утепленные, полный питательной среды каждые три дня, пока культура не достигнет примерно 80% слияния (приблизительно через 7 дней).

8. Neurаль колониеобразующих Анализ

  1. Объединить Neural формирующих колонию мобильных компонентов (NCFC) среде для анализа: NCFC бессывороточной среде, пролиферации NS-A, и раствор коллагена (3 мг / мл). Дополнение этот носитель с 2 мкг / мл гепарина, 20 нг / мл EGF, и 10 нг / мл bFGF.
  2. После диссоциации ткани гиппокампа ресуспендирования клеток в нервной колониеобразующих среды для анализа, предварительно нагретый до 37 ° С в водяной бане. Семенной клетки при клональной плотностью 1,1 × 10 5 клеток / мл в чашку для культивирования 35 мм.
  3. Инкубируйте клетки в этом полутвердой коллагеновой матрице при температуре 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 и> 95% влажности. Культура в течение 28 дней, заменяя 50% питательной среды каждые 7 дней.

9. дифференцировка нервных клеток-предшественников

  1. Добавьте достаточный объем 5 мкг / см 2 раствора ламинин , чтобы покрыть поверхность тканевой культуры , тарелкой и излечение в термостате при температуре 37 ° С в течение 24 ч перед обработкой клеток в течение отличительноеции.
    Примечание: Удалите раствор ламинина и промойте поверхность с покрытием дважды в ДЗФР непосредственно перед посевом.
  2. Когда пассажей, семена суспензии клеток в 1 х 10 4 клеток / см 2 в среде DMEM-F12 (3: 1) средства массовой информации (предварительно нагретый до 37 ° С) , дополненной 20 нг / мл EGF , и 40 нг / мл bFGF на ламинин покрытием культуры блюдо.
  3. Инкубируйте клетки при 37 ° С, 5% СО 2 и> 95% влажности и позволяют клеткам пролиферировать в течение 3 -х дней.
  4. Для того, чтобы дифференцировать адгезивных клеток-предшественников нервных, после 3-х дней заменить носитель с дифференциацией средах, содержащих DMEM-F12 (3: 1) средства массовой информации предварительно нагретом до 37 ° С, дополненной 10 нг / мл мозга нейротрофического фактора (BDNF).
  5. Во время дифференцировки заменить 50% СМИ каждые 3 дня. Дифференциация происходит постепенно, в течение примерно 21 - 28 дней.
    Внимание: После того, как клетки начинают дифференцироваться, только заменить 50% средств массовой информации на одном тименя как воздействие воздуха может оказывать вредное воздействие на здоровье клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

С помощью лабораторных нейронных предшественников количественных анализов, нейрогенеза и популяции нейрональных предшественников клеток характеризовались и сравнивались по дорсовентральной оси взрослого собачьего гиппокампе. Клетки-предшественники Нервные, полученные из изолированной гиппокампа ткани, сформированной с плавающей нейросферы в течение 14 дней изоляции, достигая диаметра 100 мкм до 28 дней культивирования. Нейросферах, полученные из спинного и брюшного изолятов не п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протоколы, описанные здесь, оптимизированы для поддержания благоприятных условий культивирования для максимизации жизнеспособности клеток. Скорость и тщательность во время экстракции, выделения и расширения имеет решающее значение. Важным шагом для установления клейкий расширения монослоя является эффективным диссоциации первичных нейросферах. После прохода, недостаточно диссоциированы нейросферы может генерировать вторичные плавающие нейросферы. Во время замены среды, эти нейросферы могут быть удалены, диссоциируют и п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям (NHMRC) Австралии (#568969 и 1004152).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,000 μ l наконечник для пипетки с фильтромAxygenTF1000
150 мм чашка ПетриBD Biosciences351058
центрифужные пробирки 15 млGreiner Bio One188271
200 μ l наконечник для пипетки с фильтромAxygenTF200
24 лунки планшет для культивированияGreiner Bio One662160
35 мм чашка для культуры тканейBD Biosciences353001
40 &; m клеточный фильтрBD Biosciences352340
6-луночный планшетдля культуры BD Biosciences351146
B-27 Добавка (50x) без сывороткиLife Technologies 
Основной фактор роста фибробластов (bFGF)Life Technologies13256029
Нейротрофический фактор мозга (BDNF)MilliporeGF029
Раствор коллагенаStem Cell Technologies04902Также доступен в наборе для анализа Neurocult NCFC от Stem Cell Technologies. Кат.: 05740 
DMEM (4,5 г/л, D-глюкоза) 500 млLife Technologies11960044
DPBSLife Technologies14190250
Эпидермальный фактор роста (EGF)BD Biosciences354001
смесь питательных веществ F-12 (ветчина) (1x) LiquidLife Technologies31765035
фетальная бычья сыворотка (FBS)Life Technologies16141079
Желатин из свиной кожи типа АSigma-AldrichG1890
L-аланил-L-глутамин дипептид (GlutaMAX)Life Technologies35050061
Гепарин натриевая соль из (свиньи)Sigma-AldrichH314950KU
ламинина (мыши)Life Technologies23017015
Среда без сыворотки NCFC (NeuroCult)Технологии стволовых клеток5720также доступен в наборе для анализа Neurocult NCFC от Stem Cell Technologies. Кат.: 05740 
Пролиферация NS-A (NeuroCult)Технологии стволовых клеток05773Также доступны в наборе для анализа Neurocult NCFC Cat: 05740 и наборе NS-A Prolieration Kit (Rat) Cat: 05771  от Stem Cell Technologies.
Базальная среда НСК (Крыса; NeuroCult)Stem Cell Technologies5770Также доступен в наборе Neurocult NS-A Prolieration Kit (Rat) от Stem Cell Technologies. Кат.: 05771 
Пенициллин/стрептомицин (5 000 ЕД/мл)Life Technologies15070063
Повидон-йодMunipharmaBetadine
Trypan синий (0,4%)Life Technologies15250061
Трипсин ЭДТАLife Technologies25200056
Шкаф биологической безопасности II классаThermoFisher ScientificSafe 2020 1.2
Нож для мозга (одноразовый)Макронож
Инкубатор для клеточных культурThermoFisher ScientificHERAcell 150i
ЦентрифугаHettichUniversal 320R
Dumont #5 ЩипцыDumont
Easypet Электрическая пипеткаEppindorf 
ГемоцитометрBoeco Bright-Line Улучшенный Neubauer
Ручные пипеткиEppindorf research
костная пила 
Лезвия скальпеля (No21)Paramount
Scissors Дельта
Водная баняГрантJB Aqua 18 plus
17504044 Осциллирующая

Ссылки

  1. Kheirbek, M. A., Hen, R. Dorsal vs ventral hippocampal neurogenesis: implications for cognition and mood. Neuropharmacol. 36 (1), 373(2011).
  2. Tanti, A., Rainer, Q., Minier, F., Surget, A., Belzung, C. Differential environmental regulation of neurogenesis along the septo-temporal axis of the hippocampus. Neuropharmacol. 63 (3), 374-384 (2012).
  3. Eriksson, P. S., et al. Neurogenesis in the adult human hippocampus. Nat Med. 4 (11), 1313-1317 (1998).
  4. Bull, N. D., Bartlett, P. F. The adult mouse hippocampal progenitor is neurogenic but not a stem cell. J Neurosci. 25 (47), 10815-10821 (2005).
  5. Kempermann, G., et al. Why and how physical activity promotes experience-induced brain plasticity. Front Neurosci. 4 (189), 1-9 (2010).
  6. Golmohammadi, M. G., et al. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26 (4), 979-987 (2008).
  7. Lowe, A., et al. Neurogenesis and precursor cell differences in the dorsal and ventral adult canine hippocampus. Neurosc. Lett. 593, 107-113 (2015).
  8. Sasaki, M., et al. MRI identification of dorsal hippocampus homologue in human brain. Neuroreport. 15 (14), 2173-2176 (2004).
  9. Powell, E. W., Hines, G. The Hippocampus. , Springer. 41-59 (1975).
  10. Jung, M. -A., et al. Canine hippocampal formation composited into three-dimensional structure using MPRAGE. J Vet Med Sci. 72 (7), 853-860 (2010).
  11. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
  12. Ray, J., Raymon, H. K., Gage, F. H. Generation and culturing of precursor cells and neuroblasts from embryonic and adult central nervous system. Methods Enzymol. 254, 20-37 (1995).
  13. Oliver-Dela Cruz, J., Ayuso-Sacido, A. Neural stem cells from mammalian brain: isolation protocols and maintenance conditions. INTECH Open Access Publisher. , (2012).
  14. Pacey, L., Stead, S., Gleave, J., Tomczyk, K., Doering, L. Neural stem cell culture: neurosphere generation, microscopical analysis and cryopreservation. Nat Protoc. , (2006).
  15. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), e2393(2010).
  16. Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. J Vis Exp. (84), e51225(2014).
  17. Lim, J. -H., Koh, S., Olby, N. J., Piedrahita, J., Mariani, C. L. Isolation and characterization of neural progenitor cells from adult canine brains. Am J Vet Res. 73 (12), 1963-1968 (2012).
  18. Herranz, C., et al. Spontaneously Arising Canine Glioma as a Potential Model for Human Glioma. J Comp Pathol. 154 (2), 169-179 (2016).
  19. Walton, R. M., Parmentier, T., Wolfe, J. H. Postnatal neural precursor cell regions in the rostral subventricular zone, hippocampal subgranular zone and cerebellum of the dog (Canis lupus familiaris). Histochem Cell Biol. 139 (3), 415-429 (2013).
  20. Walton, R. M., Wolfe, J. H. Abnormalities in neural progenitor cells in a dog model of lysosomal storage disease. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (8), 760-769 (2007).
  21. Milward, E. A., et al. Isolation and transplantation of multipotential populations of epidermal growth factor-responsive, neural progenitor cells from the canine brain. J Neurosci Res. 50 (5), 862-871 (1997).
  22. Ray, J., Peterson, D. A., Schinstine, M., Gage, F. H. Proliferation, differentiation, and long-term culture of primary hippocampal neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. 90 (8), 3602-3606 (1993).
  23. Palmer, T., Ray, J., Gage, F. FGF-2-responsive neuronal progenitors reside in proliferative and quiescent regions of the adult rodent brain. Mol Cell Neurosci. 6 (5), 474-486 (1995).
  24. Zhu, G., Mehler, M., Mabie, P., Kessler, J. Developmental changes in progenitor cell responsiveness to cytokines. J. Neurosci. Res. 56 (2), 131-145 (1999).
  25. Whittemore, S. R., Morassutti, D. J., Walters, W. M., Liu, R. -H., Magnuson, D. S. Mitogen and substrate differentially affect the lineage restriction of adult rat subventricular zone neural precursor cell populations. Exp. Cell. Res. 252 (1), 75-95 (1999).
  26. Kennedy, P. Postmortem survival characteristics of rat glial cells in culture. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 50 (6), 798-800 (1987).
  27. Viel, J. J., McManus, D. Q., Cady, C., Evans, M. S., Brewer, G. J. Temperature and time interval for culture of postmortem neurons from adult rat cortex. J. Neurosci. Res. 64 (4), 311-321 (2001).
  28. Huat, T. J., et al. IGF-1 enhances cell proliferation and survival during early differentiation of mesenchymal stem cells to neural progenitor-like cells. BMC Neurosci. 15 (91), 1-13 (2014).
  29. Supeno, N. E., et al. IGF-1 acts as controlling switch for long-term proliferation and maintenance of EGF/FGF-responsive striatal neural stem cells. Int. J. Med. Sci. 10 (5), 522-531 (2013).
  30. Ahmed, S., Reynolds, B. A., Weiss, S. BDNF enhances the differentiation but not the survival of CNS stem cell-derived neuronal precursors. J Neurosci. 15 (8), 5765-5778 (1995).
  31. Wohl, C. A., Weiss, S. Retinoic acid enhances neuronal proliferation and astroglial differentiation in cultures of CNS stem cell-derived precursors. J Neurobiol. 37 (2), 281-290 (1998).
  32. Araujo, D. M., Cotman, C. W. Trophic effects of interleukin-4,-7 and-8 on hippocampal neuronal cultures: potential involvement of glial-derived factors. Brain Res. 600 (1), 49-55 (1993).
  33. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
  34. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3 (10), 801-806 (2006).
  35. Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3 (9), 283(2005).
  36. Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, Suppl 1 112-120 (2006).
  37. Ma, W., et al. Cell-extracellular matrix interactions regulate neural differentiation of human embryonic stem cells. BMC Dev Biol. 8 (90), 1-13 (2008).
  38. Goffredo, D., et al. Setting the conditions for efficient, robust and reproducible generation of functionally active neurons from adult subventricular zone-derived neural stem cells. Cell Death Differ. 15 (12), 1847-1856 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Нейрогенез у взрослыхизоляция нейральных предшественниковкультура нейросферадгезивная монослойная культурадиссоциация трипсином-ЭДТАфильтрация через клеточный фильтрцентрифугирование с осаждениемдифференцировка под воздействием BDNFэкспрессия Nestin и Sox2
Выделение и расширение для взрослых собачьего гиппокампа Neural прекурсорах
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.