Xenopus Oositler: Mikroenjeksiyon için optimize Yöntemler, Foliküler Hücre Katmanlar çıkarılması ve Elektrofizyolojik Deneyler Hızlı Çözüm değişiklikler

Özet

Tek foliküllerin izolasyonu, sitoplazmik RNA mikroenjeksiyonları, çevre hücre tabakalarının çıkarılması ve Xenopus oositlerinde protein ekspresyonu için optimize edilmiş prosedürler anlatılmaktadır. Ek olarak, ligand kapılı iyon kanalları ile yapılan elektrofizyolojik deneylerde hızlı çözelti değişiklikleri için basit bir yöntem sunulmaktadır.

Özet

Proteinler için bir heterolog sentezleme sistemi olarak Xenopus oosit birinci Gurdon ve diğerleri tarafından tarif edilmiştir. ¹ ve yaygın olarak keşfinden beri kullanılan (Referanslar 2-3, ve oradaki referanslar). Yabancı kanal ifadesi için oosit çekici kılan bir özellik endojen iyon kanalları ⁴ kötü bolluğu. Bu ifade sistemi ligand-kapılı iyon kanalı, aralarında çok sayıda proteinlerin karakterizasyonu için yararlı olduğu kanıtlanmıştır.

GABA _A Kara kurbağası cinsi oositlerinde reseptörleri ve bunların fonksiyonel karakterizasyonu sentezleme oosit, cRNA, foliküler hücre tabakası çıkarılması ve elektrofizyolojik deneyler hızlı çözüm değişikliklerle microinjections izolasyonu da dahil olmak üzere, burada anlatılmıştır. Işlemler bu laboratuarda ^5,6 optimize edilmiş ve rutin ^7-9 kullanılan olanlardan sapma bulundu. Geleneksel olarak, soyulmuş oositler hazırlanırRT'de yumurtalık loblar uzun bir kollajenaz muamelesi ve bu soyulmuş oosit ile mRNA ile microinjected edilir. Optimize edilmiş yöntemler kullanılarak, çeşitli membran proteinleri olarak ifade edilmiştir ve rekombinant GABA _A reseptörleri ^10-12, insan rekombinant klorür kanalları ^13, tripanosom potasyum kanallarının ¹⁴ ve miyo -inositol taşıyıcı ^{15, 16} olduğu gibi, bu sistem ile incelenmiştir.

Burada ayrıntılı yöntemler, Xenopus oositlerde seçim herhangi bir proteinin ekspresyonu tatbik edilebilir, ve hızlı bir çözüm değişikliğin diğer ligand-kapılı iyon kanallarının incelemek için kullanılabilir.

Giriş

Xenopus oositleri yaygın (- 3, ve oradaki referanslar Kaynaklar 2) bir ekspresyon sistemi olarak kullanılmaktadır. Onlar düzgün montaj ve plazma zarlarının içine fonksiyonel olarak aktif birden fazla alt proteinleri dahil edebiliyoruz. Bu sistemi kullanarak, fonksiyonel olarak, tek başına ya da başka proteinlerle birlikte zar proteinleri araştırılması mutasyon, kimerik ya da birleştirilmiş proteinlerin özelliklerini incelemek için, ve potansiyel ilaçların incelenmesi için mümkündür.

başka heterolog sentezleme sistemleri üzerinden oosit kullanmanın avantajları dev hücre kolay kullanım, yabancı genetik bilgi Banyo perfüzyonu ile oo....

Protokol

Hayvan deneyleri Bern Kantonu Kantonstierarzt yerel komite, Kantonaler Veterinärdienst Bern (BE85 / 15) tarafından onaylanmıştır.

Kara kurbağası cinsi oositlerinde hazırlanması 1.

1. Katı, 20 ° C 'de muhafaza edilir, su içinde 12 saat / 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüsünde kurbağa (Xenopus laevis) tutun.
2. Dişi kurbağa ^9'dan yumurtalıkların lobları çıkarın.
   NOT: lobların kaldırma rejenerasyonu için bir uyarıcı olduğunu ve sık sık oosit kalitesi cerrahisi ile geliştirir. Oosit, bir Vitellin tabakası, folikül hücrelerinin hücre tabakası, ve kan damarları ²¹ ihtiva e....

Sonuçlar

Xenopus oositleri mekanik bir platin döngü (Şekil 1) kullanılarak ayrılmıştı. 0.5: oosit mRNA _2, δ, 0.5 p, _A reseptör alt birimleri ₄ a GABA kodlayan microinjected, 2.5 fmol / oosit (Şekil 2). 4 Gün sonra, foliküler hücre tabakaları (Şekil 3) uzaklaştırılmıştır. Oositler voltaj -80 mV'de kenetlendi ve 1 uM 3a, 21-dihidroksi-5α-pregnan-20-on (THDOC), güçlü bir pozitif allosterik modülatör mevc.......

Tartışma

Bu makalede açıklanan yöntemler geleneksel ^7-9 kullanılan sapma. 1 ila 2 saat kollajenaz muamelesi ⁸ yumurtalık lobları maruz standarttır; hasarsız, soyulmuş oosit izole; ve mRNA ticari enjeksiyon cihazlarını kullanarak bunları enjekte edin. Oositler, kollajenaz yüksek konsantrasyonda uzun maruz bırakılma ile zarar olması muhtemeldir 1): Klasik bir prosedür, aşağıdaki dezavantajları vardır. 2) kararsız soyulmuş oosit deney kadar saklanmalıdır. 3) Köreltilmiş oosit köklerinin daha mikroenjeksiyon sı.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
NaCl	Sigma	71380
KCl	Sigma	P-9541
NaHCO3	Sigma	S6014
MgSO4	Sigma	M-1880
CaCl2	Sigma	223560
Ca(NO3)2	Sigma	C1396
HEPES	Sigma	H3375
Penisilin / streptomisin	Gibco	15140-148	100 & mu; g penisilin / mL ve 100 μ g streptomisin / mL
Platin tel döngü	ev yapımı
Mikropipet çektirme	Zeitz-Instruments GmBH	DMZ
Hamilton şırınga ve nbsp;	Hamilton	80300	10 μ L, Tip 701N
Kalın duvarlı politetrafloroetilen boru	Labmarket GmBH		1.0 mm OD
Parafin yağı	Sigma	18512
Naylon ağ, G: 0,8 mm	ZBF Zü daha zengin Beuteltuchfabrik AG
Borosilikat cam tüp	Corning	99445-12	PYREX
Kollajenaz NB Standart Sınıf	SERVA	17454
Tripsin inhibitörü tip I-S	Sigma	T-9003
EGTA	Sigma	E3389
Cam kılcal	Jencons (Bilimsel) LTD.	H15/10	1.35 ID mm (perfüzyon için), alternatif şirket: Harvard Apparatus Limited
Borosilikat cam kılcal	Harvard Apparatus Limited	30-0019	1.0 OD x  0.58 ID x 100 Uzunluk mm (mikroenjeksiyon için)
Borosilikat cam kılcal damar ve nbsp;	Harvard Apparatus Limited	30-0044	1.2 OD x 0.69 ID x 100 Uzunluk mm (iki elektrotlu voltaj kelepçesi için)
& gama; -Aminobütirik asit (GABA)	Sigma	A2129
3 & alfa ;, 21-Dihidroksi-5 & alfa; -pregnan-20-on (THDOC)	Sigma	P2016
ızgara motoru	Faulhaber		DC mikromotor Tip 2230, dişli Tip 22/2
mikrometre vidalı	Kiener-Wittlin	10400	TESA, AR 02.11201
Steril plastik transfer pipetleri	Saint-Amand  Mfg.	222-20'LI YILLAR