Abstract
שחרור השלפוחית התאית (EVS) כולל exosomes נגזר endosomal הקטן (Exos, קוטר <100 ננומטר) microvesicles נגזרות הממברנה פלזמה גדולה (MVS, בקוטר> 100 ננומטר) הוא תהליך הסלולר בסיסי המתרחש בכל תאי החיים. חלבוני תחבורת שלפוחית אלה, שומני גרעין חומצות ספציפיים תא מוצאם במבחנה הדגישו את חשיבותם כמתווכים של תקשורת בין תאית. מכוניות חשמליות היו מבודדות בהצלחת נוזלי גוף שונים ובעיקר כלי רכב חשמליים בדם זוהו מבטיח סמנים לסרטן או מחלות זיהומיות. על מנת לאפשר את הלימוד תת-אוכלוסיות MV בדם, אנו מציגים פרוטוקול עבור הבידוד הסטנדרטי והאפיון של MVS מדגים דם היקפי. MVS הם pelleted ממדגמים פלזמה anticoagulated EDTA על ידי צנטריפוגה ההפרש ובדרך כלל בעל קוטר של 100 - 600 ננומטר. בשל הגודל הגדול שלהם, הם יכוליםבקלות להיחקר על ידי cytometry זרימה, טכניקה המשמשת באופן שיגרתי לדיאגנוסטיקה רפואית זמינה ברוב המעבדות. כמה דוגמאות עבור מבחני בקרת איכות של MVS מבודד תינתן וסמנים שיכולים לשמש אפליית subpopulations MV שונים בדם יוצגו.
Introduction
בשנים האחרונות רבים במבחנה הוכיח כי שלפוחית תאית (EVS) ממלא תפקיד חשוב בתקשורת בין תאית. תאים חיים לשפוך כל הזמן שלפוחית אשר שונים בגודלם, תוכן biogenesis. כלי הרכב החשמליים למדו הטוב ביותר הם exosomes שמקורם במערכת endosomal שבו הם מאוחסנים כמו שלפוחית intraluminal בגופי multivesicular. לאחר הפתיל האחרון עם קרום הפלזמה, השלפוחית הכלולה משתחררת כמו exosomes (Exos, בקוטר 30 - 100 ננומטר 1). אוכלוסייה שנייה של EV אשר צבר תשומת לב גוברת בשנים האחרונות הם microvesicles גדול (MVS, בקוטר 100 - 1,000 ננומטר) אשר יוצאים מגוף ישירות מן קרום הפלזמה 2.
שני סוגים של שלפוחית מוקפי bilayer שומנים ומכילים חומצות גרעין, למשל, דנ"א, רנ"א שליח או מירנה 3 - 5, וכן שפע של חלבונים אשר הם יכולים להעביר ג שכנהאמות. בעוד בכלל רכב החלבון של השלפוחית משקף את מצב התא ממוצא, כמה חלבונים נראים ממוקדים סלקטיבי מועשר ב -1 EVS. אינטרס מחקר עיקרי הוא לאפיין כלי רכב חשמליים מתאיים נורמלית וחולה על מנת להגדיר חתימות EV ספציפיות עלולים לאפשר את השימוש של כלי רכב חשמלי כסמנים ביולוגיים רומן. במיוחד בסרטן, שבו לעתים קרובות בגידול עצמו אינו נגיש בקלות, ביופסיות נוזלות מיקוד מכוניות חשמליים-גידולים ספציפיים בדם עשויות לאפשר ניטור של תגובות לטיפול או לעזור המאפיינות את הגידול הראשוני ללא צורך הליכים פולשניים 6.
ואכן, EVS כבר בודדו בהצלחה נוזלים שונים בגוף, כולל שתן 7, CSF 8, השד חלב 9 או דם 10. מספר מחקרים זיהו שינויים במצבת EV וקומפוזיצית מחל אנושיות שונות. לדוגמא, בחולי אלח דם במספר MVS פרו-קרישה הואהגדיל משמעותית לעומת אנשים בריאים 11. גם בחולים עם מלריה מוחין חמור עלייה MVS הכולל בדם ניתן לצפות וספירות של MVS-derived טסיות לתאם עם תרדמת עומק תרומבוציטופניה 12. מחקרים אחרים מדווחים על מספרים גבוהים של שלפוחית נגזרות האנדותל בחולים עם זאבת אדמנתית מערכתית או אי ספיקת לב, ובמקרה של האחרון, זה עולה בקנה אחד עם הסתברות גבוהה יותר של אירועים קרדיווסקולריים 13,14.
במיוחד בסרטן, EVS בדם נדון כעת כסמנים ביולוגיים רומן עם ערך דיאגנוסטיים ופרוגנוסטיים. רמות של MVS לבטא חלבוני גידולים הקשורים כגון MUC1, EGFR או FAK נראות מורמות בדמם של חולי סרטן השד 15,16. גם עבור Exos, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי Exos דם הנגזרות נושאת אנטיגנים ספציפיים הגידול כגון Glypican-1 לסרטן הלבלב או דל-1 לסרטן השד לאפשר דה המחלה בשלב מוקדםtection עם גבוהה סגולית ורגישה 17,18. בנוסף, הגידול הנגזרות בסרום Exos עשוי להכיל DNA אשר ניתן להשתמש בהם לצורך זיהוי של מוטציות כגון KRAS ו- p53 אשר מצביע על השימוש שלהם על מנת לבצע חיזוי טיפול 19. ההתקדמות שחלה באחרונה הראו כי ניתוח של Exos בדם של חולי גליובלסטומה באמצעות שבב microfluidic ספציפי המאפשר ניטור של טיפול 20. יחדיו, ממצאים אלה מרמזים כי ניתוח של תת-אוכלוסיות ספציפיות מחלות של שלפוחית נותן מידע רב ערך על האבחנה, הפרוגנוזה, כמו גם אפשרויות טיפוליות והצלחה.
עם זאת, בידוד וניתוח Exos מדם הוא גוזל זמן, דורש ציוד מעבדה מיוחד ולכן הוא עדיין לא מתאים לאבחון קליני שיגרתי. לעומת זאת, MVS ניתן לבודד הרבה יותר מהר, בשל גודלן, ניתן לנתח בקלות על ידי cytometry זרימה ללא הצורך להזדווג להם חרוזי לטקס כפי שהוא הכרחי Exos 18, 21. לכן, כאן אנו מציגים פרוטוקול שיכול לשמש עבור הבידוד הסטנדרטי של MVS מדגימה דם ואת האפיון הבא של תת-אוכלוסיות MV ידי cytometry זרימה. פרוטוקול זה יאפשר מחקר נוסף ובאפיון עומק פרופילים MV בקבוצות גדולות של מטופלים אשר יידרש על מנת להשתמש MVS לדיאגנוסטיקה רפואית היומיום.
Protocol
כל הניסויים בבני אדם כוללים אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית (אישור לא. 3/2/14). עבור הבחירה של חולים יש לציין כי מספר גורמים כמו גיל, מין, משטרי טיפול נוכחיים ועוד רבים עשויים להשפיע רכב MV בדם ולכן צריכים להילקח בחשבון לפני לדגום אוסף 22,23.
1. הכנת דוגמאות פלזמה
- צייר 1 - 2 צינורות הדם לכל התורם באמצעות מחט פרפר 21-מד לתוך צינור איסוף הדם Vacutainer המכיל EDTA (דם 1.6 מ"ג / מ"ל). הקפד להפוך את הצינור (ים) כמה פעמים כדי להבטיח קרישה בדם יעילה.
הערה: נפח הדם מומלץ cytometry זרימת עוקבות וניתוח כתם המערבי הוא 5 - 15 מ"ל. על מנת למנוע הידרדרות MV ואובדן, דגימות דם צריכים להיות מטופלים <30 דק 'לאחר נסיגת הדם. - הכינו דגימות פלסמה ידי צנטריפוגה דגימות במשך 15 דקות ב 1200 XG בבטמפרטורת החדר (RT).
- החלת מסנן שסתום כדי לעזור הפרדת הפלזמה (= שכבה עליונה) מן הנותרים כדוריים דם (= שכבה תחתונה).
- מעבירים את הפלזמה לתוך צינור 15 מ"ל.
- צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 1500 XG, RT כדי גלולת פסולת תא גדולה ולהסיר טסיות נותרים.
- מעבירים את supernatant לתוך צינור 15 מ"ל ולהמשיך ישירות עם דגימות לבידוד או חנות MV עד 6 חודשים ב -20 ° C.
הערה: הפרוטוקול המובא יכול לשמש גם כדי לבודד MVS (ו Exos) מן supernatants תרבית תאים. על מנת לעשות זאת, לטפח תאים ב 60 - 80% confluency עבור 24 - 48 שעות במדיום התרבות בתוספת FCS שלפוחית מדולדלת, ולאחר מכן לאסוף את supernatant. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 750 XG, 4 ° C כדי לרוקן תאים צפים שיורית, למלא את supernatant לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ"ל חדש שוב במשך 5 דקות ב 1500 XG, 4 ° C עד גלולה פסולת התא גדול יותר. supernatant אז זה יכול לשמש עבור בידוד של MVSכמתואר בשלב 2.1 - 2.16.
בידוד 2. MVS
- מעביר את מדגם הפלזמה בתוך שפופרת צנטריפוגה מתאימה. במידת הצורך, למלא את הצינור עם PBS כדי לדלל את המדגם ולמנוע קריסה של צינורות דקים קירות במהלך ההליך צנטריפוגה.
- צנטריפוגה במשך 35 דקות ב 14,000 XG, 4 ° C.
- supernatant למזוג, לשמור צינורות מהופכים ולשים על מגבת נייר. חכה 3 - 5 דקות עד שכל supernatant הנותרים כבר נספג מגבת והוציא ובכך מן המדגם.
- Resuspend גלולה MV ב 1,000 μL PBS, והעברת צינור צנטריפוגות 1.5 מ"ל במשך 35 דקות ב 14,000 XG, 4 ° C בצנטריפוגה השולחן.
- לשאוב supernatant.
- Resuspend גלולה MV ב 50 - 500 μL PBS, תלוי בגודל של גלולה. לחלופין, lyse MVS ישירות, למשל, במאגר ריפה (150 מ"מ NaCl / 0.1% SDS / 0.5% Na-deoxycholate / 1% Triton X-100/50 מ"מ טריס, pH 7.2)לניתוח כתם המערבי לאחר מכן. MVS החנות ב -20 מעלות צלזיוס. הם יישארו יציבים במשך כמה חודשים, אך להימנע להקפיא להפשיר מחזורים חוזרים ונשנים.
- אופציונלי: קביעת ריכוז חלבון MV עם assay חלבון (למשל, ברדפורד או שיטה לורי) על מנת להעריך תשואות MV או מינון MVS לניסויים הבאים.
- אם Exos נוספים הם להיות מבודדים מן דגימות פלזמה, למזוג supernatant משלב 2.3 לתוך צינור ultracentrifugation צנטריפוגות במשך 2 שעות ב 110,000 XG, 4 ° C. למזוג supernatant כמתואר בשלב 2.3, resuspend גלולה Exo ב 1,000 μL PBS ולהעביר לתוך קטן (1.5 מ"ל) צינורות ultracentrifugation.
- Ultracentrifuge עבור 2 שעות על 110,000 XG, 4 ° C, לשאוב supernatant גלולה Exo resuspend ב 50 - 75 μL PBS או חיץ Ripa.
אפיון 3. MVS ידי cytometry זרימה
- העברה 15 μL PBS + 1% נסיוב עגל עוברי מדולדל שלפוחית (FCS) בצינור cytometry הזרימה.
הערה: שלפוחיות מדולדל FCS הוא הוכן על ידי צנטריפוגה חום מומת (30 דקות ב 56 מעלות צלזיוס) FCS במשך 18 שעות ב 110,000 XG ו filtrating את supernatant דרך 0.2 מיקרומטר מסנן כפי שתואר לעיל 24. - הוסף 5 מיקרוגרם (במקרה של תשואות נמוכות 3 מיקרוגרם חלים גם) של MVS ב PBS.
- דגירת דגימות עבור 30 דקות ב RT על מנת לחסום אתרי קישור נוקבים על פני שטח MV ובכך להפחית מכתים רקע.
- הוספת נוגדנים שכותרתו fluorescently נגד החלבון של העניין. לכייל את כמות הנוגדנים משמשת המכתים לפני השימוש כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי ולהבטיח מנת אות לרעש נמוכה. ודא גם לכלול צינור אחד עם MVS בלא כתם כמו שליטה שלילי צינור אחד MVS מוכתם נוגדן אלוטיפ התאמת באותו ריכוז (למשל, אם 1 מיקרוגרם של הנוגדן משמש, גם להשתמש 1 מיקרוגרם של פקד אלוטיפtibody) לכמת מכתים רקע.
הערה: אפשר גם לבצע זרימת ססגוניות cytometry ידי הוספת נוגדנים מרובים מצמידים fluorochromes שונים. - דגירה במשך 20 דקות ב RT בחושך.
- הוסף 250 μL PBS והמשך עם המדידה של המדגם באמצעות cytometer זרימה.
- במקרה כזה דגימות שלא ניתן למדוד באופן מיידי, להוסיף 150 μL PBS ו -50 paraformaldehyde μL 4% (PFA) כדי לתקן דגימות ולאחסן ב 4 ° C.. זהירות: PFA הוא רעיל. יש להשתמש בכפפות וציוד מגן אישי מתאים.
- מנמיך את הסף של הזרימה cytometer לערך הנמוך ביותר האפשרי ולחפש אוכלוסיית MV באמצעות פיזור קדימה (FSC) לעומת פיזור צד (SSC) עלילת סולם לוגריתמים. שער על אוכלוסיית MV ולהעריך את אות ניאון היסטוגרמה מקביל.
אפיון 4. של MVS ידי מערבי סופג
- Resuspend גלולה MV ישירותחיץ תמוגה מתאים (למשל, Ripa חיץ).
- במקרה גלולה MV כבר resuspended ב- PBS, לדלל אותו לפחות 1: 1 חיץ תמוגה מתאים (למשל, חיץ Ripa).
- קביעת ריכוז החלבון של מדגם MV, למשל, על ידי assay לורי.
- כן 10 - 20 מיקרוגרם של MVS ב 22.5 חיץ μL ריפה. לאחר מכן מוסיפים 7.5 חיץ טעינת 4x Laemmli μL וחום במשך 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס.
- דגימות טען על ג'ל polyacrylamide ולבצע אלקטרופורזה ו immunoblotting פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
- לאחר העברת החלבונים על הממברנה, לבצע מכתים Ponceau כביקורת טעינה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
- קרום destain ב TBST במשך 5 דקות ב RT.
- קרום בלוק למשך 30 דקות עד 1 ש 'ב RT BSA 5% ב TBST.
- דגירה הממברנה עם נוגדן ראשוני על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה או ל -2 שעות ב RT.
- לשטוף את הממברנה עם דק TBST 3 x 5.
- דגירה הממברנה עם נוגדן המשני מצמידים HRP בדילול של 1: 10,000 ב 5% BSA. הערה: במקרה של אותות רקע גבוהים, להשתמש באבקת חלב במקום BSA.
- לשטוף את הממברנה עם 5 דקות 3x TBST.
- לפתח קרום עם מגיב זיהוי ECL וכדי לזהות אותות על סרטים chemiluminescence או מערכת הדמיה chemiluminescence.
הערה: כדי להפלות MVS מ Exos, חלבונים כמו טובולין, actinin-4 או mitofilin ניתן להשתמש שאמור בעיקר להיות נוכח על MVS 16,25. שים לב שרוב נוגדני tetraspanin (למשל, CD9, CD81), משמשים סמנים עבור Exos, לא לעבוד בתנאי צמצום ולכן עליו להיות מוכן במאגר טעינה הלא צמצום ואחריו חימום במשך 10 דקות ב 70 מעלות צלזיוס.
Representative Results
על מנת לכמת את התשואה של MVS כי ניתן לבודד בעקבות הפרוטוקול המתואר, חישבנו את כמות MVS מבודד דגימות דם של 10 תורמים. התשואה MV, אשר הוערכה ב assay חלבון לורי, נע בין 10 עד 30 מיקרוגרם עם ממוצע של 19.2 מיקרוגרם MVS לכל מ"ל דם (טבלה 1). ריכוז החלקיקים שנקבעו על ידי ניתוח מעקב ננו-חלקיקים (נ.ת.ע) נע בין 1.66 x 10 9 כדי 2.36 x 10 10 עם ממוצע של 5.9 x 10 9 חלקיקים לדגימה פלזמה מ"ל (טבלה 2). אפיון נוסף של MVS ידי מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים חשף אוכלוסייה של שלפוחית עם ננומטר בקוטר> 100 כי היו מוקפות bilayer שומנים ולא מכילה אברונים בתא (איור 1 א). נ.ת.ע אשר כי גודל MVS המבודד נע בין 100 עד 600 ננומטר (איור 1 ב ') ואת גודל MV הממוצע היה 201ננומטר (איור 1 ג). מכתים עבור סמני MV ו Exo טיפוסיים על ידי מערבי סופג הוכיח כי MVS המבודד היו חיוביים עבור טובולין ורק הראה ביטוי קל של CD9 ו- CD81, תוך Exos היו שלילי עבור טובולין ו מועשר CD9 ו- CD81 (איור 2).
הניתוח של MVS מבודד על ידי cytometry זרימה (איור 3 א) חשף אוכלוסיית שלפוחית מוגדרת שאפשר מגודרת באמצעות אותם הפרמטרים המשמשים בדרך כלל עבור MVS המבודד supernatants תרבית תאים וזה היה שונה בעליל מן אות הרקע מתקבלת על ידי מדידת PBS + 1% שלפוחית מדולדלת FCS ללא תוספת של MVS (איור 3 ב). על מנת לנתח את אוכלוסיות MV השונות נוכח דם, MVS הוכתם סמנים הוקמו עבור אוכלוסיות תאי דם השונות, למשל, CD62P עבור MVS מטסיות CD45 עבור MVS הנגזרות לויקוציטים, CD235a עבורדם אדום תא נגזר MVS ו CD62E עבור MVS תא נגזרות האנדותל (איור 4). אפיון זה הראה כי אחוז subpopulations MV שונה בין דגימות דם התורם נחקר, בעוד שרוב MVS נראה להישפך על ידי טסיות כל הדגימות.
איור 1: התפלגות גודל של MVS המבודדת מן הדם היקפי. A, MVS מבודד היו דמיינו ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים. B, ניתוח מעקב nanoparticle הנציג (נ.ת.ע) של MVS הממחישה את התפלגות הגודל של השלפוחית. C, גודל MV הממוצע מתחייל 10 הכנות עצמאיות נמדד על ידי נ.ת.ע (ממוצע). אנא לחץ כאן על מנת לצפות אלגרסת arger של נתון זה.
איור 2: אפיון של MVS מבודדת על ידי המערב סופג. ביטוי חלבון דיפרנציאלי על MVS מבודד Exos משני תורמים היה דמיין ידי מערבי סופג. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: ניתוח של MVS ידי cytometry זרימה. A, MVS הם מדמיינים ראשונים על קדימה (FSC) לעומת sidescatter (SSC) מגרשי שער על אוכלוסיית MV בהתאמה. בהמשך לכך, MVS אלה מאופיינים עבור האנטיגן של עניין על ידי באמצעות נוגדנים שכותרתו fluorescently מכוונים נגד אנטיגן. B, טיפוסית FSC לעומת מגרשים SSC עבור MVS מבודד מן הפלזמה של שני תורמים. בתור השוואה, מגרש אופייני MVS-derived תאים סרטניים מתאי סרטן ריאות A549 מבודד supernatant תרבית תאים כמו גם כביקורת שלילית רק באמצעות PBS + 1% שלפוחית מדולדל FCS ללא MVS מוצגים בצד ימין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: אפיון MVS מבודד על ידי cytometry זרימה. MVS משלושה תורמים התאפיין עבור הביטוי של סמני תא הדם הוקמו (אדום) על ידי cytometry זרימה. הפקדים אלוטיפ בהתאמה מוצגים באפור.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig4large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| לִטעוֹם | MVS / מ"ל דם [מיקרוגרם] |
| # 1 | 29.4 |
| # 2 | 10.3 |
| # 3 | 15.2 |
| # 4 | 31.1 |
| # 5 | 18.8 |
| # 6 | 22.7 |
| # 7 | 19.1 |
| # 8 | 18.7 |
| # 9 | 15.0 |
| # 10 | 11.9 |
טבלת 1: תשואת חלבון MV מדגים דם היקפי.
| לִטעוֹם | MVS / פלזמה מ"ל [ספירת חלקיקים] |
| # 1 | 6.42E + 09 |
| # 2 | 2.36E + 10 |
| # 3 | 1.88E + 09 |
| # 4 | 6.51E + 09 |
| # 5 | 3.48E + 09 |
| # 6 | 4.57E + 09 |
| # 7 | 2.09E + 09 |
| # 8 | 1.66E + 09 |
| # 9 | 2.54E + 09 |
| # 10 | 6.20E + 09 |
טבלה 2: MV חלקיקי תשואה מן הדם היקפי דוגמאות.
Discussion
מחקרים שנעשו לאחרונה על כלי רכב חשמליים בדם הוכיחו כי הרכב וספירת EV להשתנות במהלך הגורם מספר מחלות. לכן, הניתוח ואפיון נוסף של כלי הרכב חשמליים האלה הם של ריבית גבוהה עוד יותר להעריך פוטנציאל השימוש שלהם כסמנים ביולוגיים המחלה לאבחון ופרוגנוזה או להעריך תגובות טיפול. הפרוטוקול אנו מציגים כאן מאפשר בידוד של שלפוחית בקוטר של עד 600 ננומטר אשר אינם כוללים כל האברונים בתא. תצפיות אלו עולים בקנה אחד עם ההגדרה הנוכחית של MVS ואינן כוללות נוכחות של גופים אפופטוטיים 2. שימוש המערבי סופג, הצלחנו להוכיח כי MVS מבודדים להראות ביטוי גבוה של טובולין, בעוד tetraspanins CD9 ו- CD81 המשמשים לעתים קרובות כסמנים Exo היו רק מעט לידי ביטוי. זו מאשרת כי MVS נבדל Exos ומתאים לאפיון מעמיק האחרון והשוואה של שתי אוכלוסיות EV ידי פרוטאומיקה 25.
תוכן "> במהלך הרכישה של דגימות דם, חשוב לשמור את הזמן בין venipuncture והכין פלזמה קצרה ככל האפשר על מנת למנוע הידרדרות MV. יתר על כן, אחסון ממושך של דגימות דם יכול להוביל ההפעלה של תאי דם גורמת MV משופרת משיל ובסופו של הדבר אפופטוזיס אשר גורם לשחרור של גופים אפופטוטיים. שיקול חשוב נוסף עבור בידוד MV הוא למנוע זיהומים של הכנות MV עם חלבוני פלזמה או Exos הקטן. לכן, חשוב להסיר כמה שיותר supernatant ככל האפשר לאחר שצנח MVS ב g 14,000 x. מאחר הגלולה גלויה כרגיל במהודק אל הקיר של הצינור, supernatant ניתן להסיר בקלות עם קצה פיפטה. בניגוד Exos אשר נוטה ליצור אגרגטים במהלך ההכנה ידי ultracentrifugation במהירות גבוהה לעתים קרובות קשה resuspend, בעיה זו אינה מתרחשת עם MVS.המחקר שלנו מראה שזה possible לאפיין תת-אוכלוסיות MV נוכח הדם על ידי cytometry הזרימה. למרות גבול הגילוי של cytometers הזרימה ביותר הוא סביב 200 - 300 ננומטר, MVS נמדד reproducibly ב תורם וכן דגימות תרבית תאים עם אותם הפרמטרים של ניתוח והשערים שאפשרו ההבחנה שלהם בבירור מפני אותות רקע. חשוב לוודא לפני המדידות כי PBS המשמש בניתוחים אינו מכיל חלקיקים מזהמים שעלולים לגרום רקע גבוה במהלך cytometry זרימה (איור 3). למרות שחלק MVS קטן אולי לא ליפול בפח גישה תזרים cytometric, זיהינו MVS מכל אוכלוסיות תאים הדם הגדולים (למשל, טסיות, תאי דם אדומים, כדוריות דם לבנות, תאי אנדותל). בניתוחים שלנו השתמשנו סמנים סטנדרטיים עבור תאי הדם השונים אשר כבר נמצאו בעבר על MVS 26 - 29. יצוין כי על מנת להשיג את התוצאות הטובות ביותר על ידי זרימת cytometry, tהוא להסתכם וריכוז כל הנוגדנים יש טיטרציה על מדגם MV לבטא את האנטיגן של עניין. אם תת-אוכלוסיות MV ספציפיות בדם תזוהינה עם ייחוד גבוה, ניתן לבצע צביעה כפולה כנגד שני אנטיגנים שונים המצויים על גבי MVS בהתאמה ורק לשקול כל MVS הכפול החיובי לאחר מנתח 23. נכון לעכשיו, יש מאמצים כדי להגדיר טווח רמה תת-אוכלוסיות MV בדם של אנשים בריאים 23,30. מחקרים אלה הראו כבר כי MVS-derived טסיות מהווים את האוכלוסייה הגדולה ביותר של MVS בדם שנמצא התכתבות עם התצפיות שלנו.
אחד יתרונות של cytometry זרימה לאפיין דגימות MV שהשיטה הזאת היא הוקמה כבר היטב למטרות אבחון ברוב מרכזי הקלינית אשר תאפשרנה את השימוש האפשרי של MVS כסמנים ביולוגיים אבחון קליני יומיומי. מחקרים קודמים על כלי רכב חשמליים בדם אשר יש בעיקר להתמקדאד על Exos הקטן, להסתמך על נהלים ספציפיים מיון או לנתח את אוכלוסיית יעד Exo הרצויה סלקטיבי 31,32 או דורש זמן רב (2 ימים) תהליך בידוד עם צימוד של Exos לטקס חרוזים לפני ניתוח 18. התצפיות לא פורסמו שלנו מראות כי ניתוח התזרים cytometric של MVS מן הכנות דם כולו ואף מאפשר זיהוי של MVS כגון MVS נגזרות גידול ללא כל תהליכי מיון כזה.
יחדיו, הפרוטוקול המובא כאן מאפשר הבידוד המהיר של MVS מדגים דם היקפי עם ציוד מעבדה סטנדרטי והאפיון הבא שלהם באמצעות cytometry זרימה ו מערבי סופג. התהליך כולו יכול להתבצע סביב 2 שעות אשר יקל במחקרים עתידיים על פרופילים MV ב 'הדם החולים נדרשים להעריך את הפוטנציאל של MVS כסמנים ביולוגיים למחלה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| butterfly needle (21 gauge) | Hospira Deutschland GmbH | 490P29201 | |
| Bovine serum albumin Fraction V | Roth | 8076.3 | For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H2O and adjust pH to 7.6 |
| For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H2O and add 1 mL Tween-20 | |||
| CD235a-PE | Beckman Coulter | A07792 | use 5 µl for staining |
| CD45-FITC | Beckman Coulter | 7782 | use 5 µl for staining |
| CD62E-PE | Biolegend | 336008 | use 0.8 µg for staining |
| CD62P-PE | Biolegend | 304905 | use 0.1 µg for staining |
| CD81 antibody | Biolegend | 349501 | 1:2,000 in 5% BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting |
| CD9 antibody | Immunotools | 21270091 | 1:1,000 in 5% BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting |
| Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000 | Fujitsu Life Sciences | ||
| DC protein assay kit II | Bio-Rad | 5000112 | |
| ECL detection reagent | GE Healthcare | RPN2232 | |
| EDTA vacutainers for blood collection | Sarstedt | 01.1605.001 | |
| FACSCanto II | BD Biosciences | ||
| fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 10091148 | heat-inactivated (30 min, 56 °C) |
| filter 0.22 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HRP-coupled anti-mouse secondary antibody | santa cruz | sc-2005 | use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T |
| HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody | santa cruz | sc-2004 | use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T |
| 4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1 | Roth | K929.1 | |
| microfuge SIGMA 1-15K | Sigma Laborzentrifugen | ||
| milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk) | BioRad | 170-6404 | |
| multifuge 3 L-R | Heraeus | ||
| NanoSight LM10 | NanoSight Ltd. | ||
| PBS, w/o Ca and Mg | Pan biotech | P04-36500 | |
| perfusor syringe 50 mL | Braun | 8728844F | |
| Ponceau-S staining solution | PanReac AppliChem | A2935,0500 | |
| rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6 x 17 mL) | Beckman Coulter | ||
| rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10 x 1.5 mL) | Beckman Coulter | ||
| tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom) | BD Biosciences | 352054 | |
| tubes for ultracentrifugation (15 mL) | Beckman Coulter | 344061 | |
| tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm) | Beckman Coulter | 343778 | |
| Tubulin antibody | Millipore | 05-829 | 1:5,000 in 5%BSA in TBST |
| ultracentrifuge Optima L-80 XP | Beckman Coulter | ||
| ultracentrifuge TL-100 | Beckman Coulter | ||
| valve filter Seraplas V15 | Sarstedt | 53,428 | |
References
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4 (0), (2015).
- Guescini, M., Genedani, S., Stocchi, V., Agnati, L. F. Astrocytes and Glioblastoma cells release exosomes carrying mtDNA. J Neural Transm (Vienna). 117 (1), 1-4 (2010).
- Balaj, L., et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nat Commun. 2, 180 (2011).
- Lee, T. H., et al. Oncogenic ras-driven cancer cell vesiculation leads to emission of double-stranded DNA capable of interacting with target cells. Biochem Biophys Res Commun. 451 (2), 295-301 (2014).
- Chi, K. R. The tumour trail left in blood. Nature. 532 (7598), 269-271 (2016).
- Pisitkun, T., Shen, R. -F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (36), 13368-13373 (2004).
- Harrington, M. G., et al. The morphology and biochemistry of nanostructures provide evidence for synthesis and signaling functions in human cerebrospinal fluid. Cerebrospinal Fluid Res. 6, 10 (2009).
- Admyre, C., et al. Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk. J Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
- Caby, M. -P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol. 17 (7), 879-887 (2005).
- Nieuwland, R., et al. Cellular origin and procoagulant properties of microparticles in meningococcal sepsis. Blood. 95 (3), 930-935 (2000).
- Mfonkeu, J. B. P., et al. Elevated Cell-Specific Microparticles Are a Biological Marker for Cerebral Dysfunctions in Human Severe Malaria. PLoS One. 5 (10), e13415 (2010).
- Parker, B., et al. Suppression of inflammation reduces endothelial microparticles in active systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis. 73 (6), 1144-1150 (2014).
- Nozaki, T., et al. Prognostic value of endothelial microparticles in patients with heart failure. Eur J Heart Fail. 12 (11), 1223-1228 (2010).
- Galindo-Hernandez, O., et al. Elevated concentration of microvesicles isolated from peripheral blood in breast cancer patients. Arch Med Res. 44 (3), 208-214 (2013).
- Menck, K., et al. Tumor-derived microvesicles mediate human breast cancer invasion through differentially glycosylated EMMPRIN. J Mol Cell Biol. 7 (2), 143-153 (2015).
- Moon, P. -G., et al. Identification of Developmental Endothelial Locus-1 on Circulating Extracellular Vesicles as a Novel Biomarker for Early Breast Cancer Detection. Clin Cancer Res. 22 (7), 1757-1766 (2016).
- Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
- Kahlert, C., et al. Identification of Double-stranded Genomic DNA Spanning All Chromosomes with Mutated KRAS and p53 DNA in the Serum Exosomes of Patients with Pancreatic Cancer. J Biol Chem. 289 (7), 3869-3875 (2014).
- Shao, H., et al. Protein typing of circulating microvesicles allows real-time monitoring of glioblastoma therapy. Nat Med. 18 (12), 1835-1840 (2012).
- Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J Vis Exp. (59), (2012).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2 (0), (2013).
- Gustafson, C. M., Shepherd, A. J., Miller, V. M., Jayachandran, M. Age- and sex-specific differences in blood-borne microvesicles from apparently healthy humans. Biol Sex Differ. 6, (2015).
- Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 3 (0), (2014).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Dignat-George, F., Boulanger, C. M. The Many Faces of Endothelial Microparticles. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 27-33 (2011).
- Esser, M. T., et al. Differential Incorporation of CD45, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), and Major Histocompatibility Complex Class I and II Molecules into Human Immunodeficiency Virus Type 1 Virions and Microvesicles: Implications for Viral Pathogenesis and Immune Regulation. J Virol. 75 (13), 6173-6182 (2001).
- Canellini, G., et al. Red blood cell microparticles and blood group antigens: an analysis by flow cytometry. Blood Transfus. 10 (2), s39-s45 (2012).
- Scholz, T., Temmler, U., Krause, S., Heptinstall, S., Lösche, W. Transfer of tissue factor from platelets to monocytes: role of platelet-derived microvesicles and CD62P. Thromb Haemost. 88 (6), 1033-1038 (2002).
- Berckmans, R. J., et al. Cell-derived microparticles circulate in healthy humans and support low grade thrombin generation. Thromb Haemost. 85 (4), 639-646 (2001).
- Rupp, A. -K., et al. Loss of EpCAM expression in breast cancer derived serum exosomes: role of proteolytic cleavage. Gynecol Oncol. 122 (2), 437-446 (2011).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).
