制备了一种微流控芯片，用于生成成对的金点以实现串联气泡产生，并在附近形成纤维连接蛋白包被的岛状结构用于单细胞图案化。通过粒子图像测速技术对所产生的流场进行了表征，并用于研究多种生物效应，包括细胞膜穿孔、膜形变以及细胞内钙离子响应。
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本文内容
摘要
摘要
本文中，我们首先描述了一种微流控芯片的制备方法，该芯片在同一块玻璃基底上具有金点和纤连蛋白包被区域，可精确控制串联气泡的生成，并在明确定义的位置和形状上实现邻近单个细胞的图案化。接着，我们通过使用两束脉冲激光以数微秒的时间延迟分别照射一对金点，展示了串联气泡的生成过程。我们利用高速成像技术观察气泡-气泡相互作用及射流的形成，并采用粒子图像测速技术（PIV）对所产生的流场进行表征。最后，我们展示了该技术在单细胞分析中的一些应用，包括大分子摄取的细胞膜穿孔、通过整合素结合微珠位移测定的局部膜形变，以及基于比率成像的细胞内钙离子响应。实验结果表明，串联气泡相互作用可产生快速且具有方向性的射流，从而在邻近生长的细胞表面施加高度局域化的剪切应力。此外，通过调节细胞与串联气泡之间的 standoff 距离以改变射流强度，可诱导不同的生物效应。
引言
人们日益认识到，在大量细胞群体中，由于基因、蛋白质和代谢物的随机表达，细胞间存在异质性，这种异质性是生物学中细胞适应与进化的基本原理之一1。因此，采用基于群体的总体测量方法来理解单个细胞的功能及其相互作用，往往不准确且不可靠。因此，开发用于单细胞分析的新技术在生物学和药理学研究中备受关注，例如可用于更深入地理解干细胞生物学和癌症治疗中的关键信号通路与过程2-4。近年来，微流控平台的出现极大地推动了单细胞分析的发展，通过新颖的分析策略实现了对单个细胞的定位、处理及其响应的观测5。
空化现象在多种生物医学应用中发挥着重要作用，包括高强度聚焦超声（HIFU）治疗癌症6、冲击波碎石术（SWL）无创粉碎肾结石7、通过声穿孔实现药物或基因递送8，以及最近报道的由流体动力学气泡空化导致的细胞或组织破坏9,10。然而，空化气泡与生物组织及细胞相互作用的动态过程尚未被充分理解。这主要是由于超声、冲击波以及局部液压所引发的空化起始和气泡动力学具有随机性；此外，目前仍缺乏能够解析生物细胞固有复杂且快速响应的有效技术，尤其是在单细胞水平上。
由于这些挑战，很少有研究在严格控制的实验条件下探讨气泡与细胞之间的相互作用也就不足为奇了。例如，已有研究利用微流控通道中激光生成的单个气泡，展示了悬浮状态....
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方案
1. 微型制造
注意：所有微加工步骤均在洁净室中进行。微加工前需设计铬掩模，见图2。
图 2：微流控芯片中通道设计的示意图及工作单元的尺寸。a) 对准的 PDMS 微通道（绿色）与玻璃基底上图案（蓝色和红色）的掩模设计。b) 工作单元阵列代表性区域的掩模设计放大图。c) 一个工作单元的示意图，显示细胞图案（蓝色）和一对金点（红色）。所有长度标尺均显示在右下角。请点击此处查看该图的放大版本。
- 金点图案化
注意：每个金点的面积设计为 25–30....
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结果
本研究中描述的微流控平台可用于研究气泡-气泡相互作用，并在单细胞水平上分析多种空化诱导的生物效应。本文展示了多个示例，以说明在本实验系统中可开展的各种实验研究和生物检测。首先，我们将阐述串联气泡在射流形成过程中的瞬态相互作用、相应流场的可视化以及射流速度的计算（图5a）。随后，我们将展示串联气泡引起的局部细胞膜变形（图5b）、通过PI摄取实现的精确定位膜穿孔（图5c）以及细胞内钙离子响应（图5d）的示例。其他示例，如细胞活力和细胞凋亡检测，可参见参考文献22。
图5a展示了通过高速成像捕捉到的串列气泡相互作用及射流形成的示例，以及通过PIV揭示的相应流场。具体而言，在第一个气泡B1（在0 µs时产生）达到最大膨胀后，其坍塌过程受到第二个气泡B2
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讨论
单细胞分析与活细胞成像相结合，极大地加深了我们对单个细胞中动态且常具异质性的生物学过程的理解，例如表型发育和免疫应答23。与传统的培养皿或培养瓶中的细胞培养相比，微流控系统能够实时精确调控单细胞水平的微环境。因此，微流控技术与方法的进步显著提高了单细胞分析的通量和可重复性。通过整合软光刻和表面图案化技术，微流控系统可进一步设计用于深入分析单个细胞对时空动态变化刺激复杂模式的响应。例如，已成功向单个细胞递送瞬时的化学或机械信号，同时自动记录并分析其生物学或机械学响应24。尽管总体趋势如此，微流控技术在细胞水平上用于分析空化效应所诱导的生物效应仍十分有限。尤其值得注意的是，目前仅将其应用于被微柱捕获的悬浮单细胞中气泡诱导的膜穿孔研究11。在大多数贴壁细胞的研究中，通过控制细胞形态以保持动态气泡-细胞相互作用一致性的优势，要么无法实现，要么在很大程度上被忽视。
我们开发了一种微流控系统，可精确控制空化气泡的产生、后续膨胀及溃灭动力学过程；实现气泡间相互作用并形成射流；同时调控细胞的形态、取向、黏附模式以及与气泡之间的 st.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢杜克大学SMIF洁净室设施的使用支持。同时感谢郝强在测量射流速度方面提供的帮助。作者感谢Hadland Imaging公司的Todd Rumbaugh提供了本研究中使用的Shimadzu HPV-X高速摄像机。本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）通过资助编号5R03EB017886-02和4R37DK052985-20提供资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>试剂/材料 | |||
| 75 mm × 38 mm 普通载玻片 | 康宁 | 2947-75X38 | |
| 丙酮 | Sigma Aldrich, Co. | 320110 | ACS试剂， ≥99.5% |
| 异丙醇 | Sigma Aldrich, Co. | W292907 | ≥99.7%，FCC，FG |
| 硫酸 | Sigma Aldrich, Co. | 320501 | ACS试剂，95.0-98.0% |
| 过氧化氢 | Sigma Aldrich, Co. | 216763 | 30 wt.% in H2O |
| 引物 P-20 | 微化学 | MCC引物80/20 | |
| NFR光刻胶 | JSR | NFR016D2 | |
| 光刻掩模 | Photoplotstore | N/A | 4x4 直接写入掩模 |
| MF-319 显影剂 | 希普利（罗门哈斯） | Microposit MF-319 | |
| 1165 光刻胶去除剂 | 陶氏化学公司 | DEM-10018073 | 基于1-甲基-2-吡咯烷酮的 |
| S1813 光刻胶 | 希普利（罗门哈斯） | S1813 | |
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) | |
| HEPES | 赛默飞世尔科技 | 15630080 | |
| 石蜡膜 | HACH | 251764 | |
| SU-2025 光刻胶 | 微化学 | SU-2025 | |
| PDMS | 道康宁 | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 微孔管 | Saint-Gobain PPL 公司 | S-54-HL | |
| 金属针 | 新英格兰小型管 | NE-1300-01 | 直切管，0.025” OD × 0.017” ID × 0.50” 长 |
| HeLa 细胞 | 杜克大学细胞培养中心 | (307-CCL-2) HeLa，第148页 | |
| DPBS (1x) 缓冲液 | 赛默飞世尔科技 | 14190144 | |
| DMEM培养基 | 赛默飞世尔科技 | 11995065 | |
| 纤维连接蛋白 牛 蛋白，血浆 | 赛默飞世尔科技 | 33010018 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA（1×） | 赛默飞世尔科技 | 25200056 | |
| 碘化丙啶 | 赛默飞世尔科技 | P21493 | |
| 羧酸盐微球 1.00 μm | Polysciences, Inc | 08226-15 | |
| 羧基微球 2.00 μm | Polysciences, Inc | 18327-10 | |
| EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐） | 赛默飞世尔科技 | 22980 | |
| Sulfo-NHS | 磺基-NHS（N-羟基琥珀酰亚胺） | 24510 | |
| Peptite-2000 | Advanced BioMatrix | 5020-5MG | |
| FITC Annexin V | 赛默飞世尔科技 | A13199 | |
| Fura-2, AM | 赛默飞世尔科技 | F1221 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Co. | D2650 | |
| F-127 | invitrogen | P6866 | 0.2 µm 过滤（水中 10% 溶液） |
| 低血清培养基 | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| <强>名称 | <强>公司 | <强>货号 | <强>评论 |
| <强>仪器设备 | |||
| 等离子体灰化器 | Emitech | K-1050X | O2 / 光刻胶及其他有机材料的氩等离子体灰化 |
| 掩模对准器 | SUSS MicroTec | Karl Suss MA6/BA6 | |
| 电子束蒸发仪 | CHA Industries | CHA Industries Solution E-Beam | |
| RIE | Trion Technology | Trion Technology Phantom II | （氧化物/氮化物/聚合物）刻蚀 |
| 体视显微镜 | AmScope | American Scope SM-4TZ-FRL | 体视显微镜 |
| 注射泵 | Chemyx 公司 | NanoJet | |
| 细胞培养箱 | NuAire | AutoFlow NU-8500 水套式二氧化碳培养箱2 培养箱 | |
| 生物安全柜 | NuAire | NU-425-400 | |
| 水浴锅 | VWR | 1122s | |
| 离心 | IEC | Centra CL2 | |
| 显微镜 | Zeiss | Axio Observer Z1 | |
| Nd:YAG激光器 （激光器1） | New Wave Research | 风暴 | |
| Nd:YAG 激光器 （激光器 2） | 新波研究 | Orion | |
| 延时发生器 | 伯克利核子学 | BNC 565-8c | |
| 闪光灯 | Dyna-Lite | ML1000 光纤耦合闪光灯 | |
| 高速相机 | DRS Hadland | Imacon 200 | |
| 高速 相机 | 岛津 | HPV-X | |
| 高速相机 | 视觉研究 | Phantom V7.3 | |
| PIV 软件 | LaVision | DaVis 7.2 | |
| 相机 | Zeiss | AxioCam MRc 5 | |
| 软件 | Zeiss | AxioVision | |
| PTI 系统 | Horiba | S/N: 1705 RAM-X | |
| EasyRatio 软件 | Horiba | Easy Ratio Pro 2 | 版本 2.3.125.86 |
| 63× 目的 | 蔡司 | LD Plan Neofluar |
参考文献
- Wang, D., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
- Weaver, W. M., et al. Advances in high-throughput single-cell microtechnologies. Curr Opin Biotechnol. 25, 114-123 (2014).
- Gossett,....
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重印与许可
