يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

مختبر إنتاج مقياس وتنقية من الأجسام المضادة العلاجية

17.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/55153

⸱

يناير 24, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Pharmacy, University of Sydney

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول إنتاج الأجسام المضادة العلاجية في نظام التعبير الثدييات. وتشمل الأساليب المذكورة إعداد الحمض النووي ناقلات، ترنسفكأيشن مستقرة والتكيف المصل خالية من الجنينية خط الخلية الكلى 293 البشري، وإنشاء الثقافات على نطاق واسع وتنقية باستخدام تقارب اللوني.

الملخص

يبدأ ضمان الإنتاج الناجح للجسم المضاد العلاجي في وقت مبكر من عملية التطوير. المرحلة الأولى هي التعبير الناقل لجينات الأجسام المضادة متبوعا بتعداء مستقر في خط خلوي مناسب. تخضع المستنسخة المستقرة للفحص من أجل اختيار تلك المستنسخة ذات خصائص الإنتاج والنمو المرغوبة. هذه خطوة حاسمة وإن كانت تستغرق وقتا طويلا في هذه العملية. يأخذ هذا البروتوكول في الاعتبار اختيار النواقل وتحديد مصادر تسلسل الأجسام المضادة للتعبير عن الجسم المضاد العلاجي. تصف الطرق تحضير الحمض النووي الناقل من أجل التعدي المستقر لمتغير معلق من خط خلايا الكلى الجنينية البشرية 293 (HEK-293) ، باستخدام بولي إيثيلينيمين (PEI). يتم نقل الخلايا كخلايا ملتصقة في وسائط تحتوي على مصل لزيادة كفاءة التعدي ، وبعد ذلك يتم تكييفها مع الظروف الخالية من المصل. يتم استخدام الإنتاج على نطاق واسع ، الذي تم إعداده كمزارع متضخمة على الدفعات لإنتاج بروتين الجسم المضاد الذي يتم تنقيته بواسطة كروماتوغرافيا التقارب باستخدام أداة كروماتوغرافيا سائل البروتين السريع الآلية (FPLC). يمكن أن توفر إنتاجية الأجسام المضادة التي تنتجها هذه الطريقة بروتينا كافيا لبدء التوصيف الأولي للجسم المضاد. قد يشمل ذلك تطوير الفحص في المختبر أو التوصيف الفيزيائي الكيميائي للمساعدة في المهمة التي تستغرق وقتا طويلا المتمثلة في الفحص النسيلي للمرشحين الرئيسيين. يمكن أن تكون هذه الطريقة قابلة للتحويل إلى تطوير نظام تعبير لإنتاج الأجسام المضادة الحيوية.

المقدمة

استمر نجاح الأجسام المضادة العلاجية لدفع استثمارات كبيرة في تطوير الأجسام المضادة كوسيلة لموجة من العلاجات الجيل القادم تبدأ. ومن المتوقع أن يتم إعادة تشكيل بشظايا الضد 1، تقارن الضد المخدرات 2، والأجسام المضادة bispecific 3 والأجسام المضادة هندسيا مع خصائص مواتية 4 السوق الأجسام المضادة. فئة أخرى كسب الفائدة الدوائية هي البدائل الحيوية. الأجسام المضادة بدائل حيوية هي "مشابهة للغاية" تكرار المنتجات من الأجسام المضادة العلاجية التي حصلت بالفعل على موافقة الجهات التنظيمية. يجب أن تكون بدائل حيوية المقترحة قابلة للمقارنة مع الأجسام المضادة المنشئ فيما يتعلق بنيته، وظيفة، سمية الحيوانية والسلامة السريرية والفعالية والدوائية الإنسان (PK)، الدوائية (PD) والمناعية 5، 6.

موافقة صوقد آتش الأجسام المضادة بدائل حيوية بطيئا بسبب القيود الصارمة على الجودة النهائية للمنتج. عمليات التصنيع الدقيقة مثل خطوط الخلايا وشروط زراعة محددة وصولا إلى خطوات المعالجة النهائية يمكن أن تبقى الملكية. ما هو أكثر من ذلك، تصنيع الأجسام المضادة ينطوي بطبيعته على درجة من التباين التي يمكن أن تضيف إلى التحدي المتمثل في إنتاج منتج مماثل للغاية. توصيف والمقارنة الفيزيائية والفيزياء الحيوية شامل من الصعب جدا، ولكن عددا من الدراسات مما يدل على خصائص الأجسام المضادة بدائل حيوية تظهر في الأدب 7، 8، 9.

توليد الأجسام المضادة العلاجية يبدأ ترنسفكأيشن من الخلايا المضيفة الثدييات مع ناقلات تحمل جينات الأضداد منها. تصميم ناقلات، خط الخلية والثقافة الشروط هي الاعتبارات الأساسية لإعداد السابقنظام الضغط و.

تسلسل الحمض النووي من الأجسام المضادة يمكن أن يكون مصدر من البنك المخدرات (www.drugbank.ca)، IMGT (www.igmt.org) أو المنشورات البحثية بما فيها براءات الاختراع. على سبيل المثال، وتسلسل تراستوزوماب يتوفر من خلال بنك المخدرات (ID DB: DB00072). تسلسل الأحماض الأمينية من المناطق المتغيرة يمكن أن يخضع تصميم الجينات والاستغلال الامثل للتركيب في الأنواع المضيفة المطلوب. من المهم بالنسبة الأجسام المضادة بدائل حيوية أن يتم إجراء أي تعديل لتسلسل الأحماض الأمينية. مرة واحدة توليفها، الجينات الأجسام المضادة يمكن subcloned في ناقلات المناسبة في الاختيار.

تتكون الأجسام المضادة البشرية من سلسلتين الثقيلة متطابقة وسلسلتين ضوء متطابقة. التعبير ينظم بإحكام كل السلاسل هو ضروري لإنتاج الأمثل للمغاير البروتين مفتش في خلايا الثدييات 10. داخل الإقليم مثل جيدا يجب أن تشكل السندات ثاني كبريتيد بين سلسلة وعدد من التعديلات بعد متعدية يجب أن تكون فيعرضوا خلال الحيوي البروتين. تتوفر التي تم تصميمها خصيصا للتعبير عن الجينات الأجسام المضادة (الرجوع إلى جدول المواد) وهناك عدد من ناقلات. هذه النواقل الضد محددة عادة ما تعبر عن ومناطق ثابتة لسلاسل حد سواء الثقيلة والخفيفة وذلك فقط في مناطق مختلفة من كل سلسلة تتطلب الاستنساخ.

ترنسفكأيشن من الخلايا مع اثنين من بنيات المستقلة (شارك في ترنسفكأيشن) هو النهج الأكثر شيوعا لإيصال الجينات الثقيلة والخفيفة ترميز السلسلة. وهذا هو، هو الدافع وراء كل جين من قبل المروج الخاص بها ونسخها كما سلاسل الأجسام المضادة منفصلة قبل أن يتم تجميعها في الشبكة الإندوبلازمية. من ناحية أخرى، ناقلات متعددة cistronic لها العناصر الداخلية الريبوسوم دخول موقع (IRES) تأسست التي تسمح التعبير عن الجينات متعددة كما نسخة مرنا واحد مع ترجمة المسموح بها من المناطق الداخلية للمرنا 11. في هذه الحالة، تقترن جينات ترميز السلسلة الثقيلة والخفيفة في arrangement لتحقيق التعاون في التعبير عن كل من سلاسل الأجسام المضادة 10 و 12.

في حين أن الخلايا transfected عابر إنتاج البروتين الكافي لإنجاز عدد محدود من التجارب، وخطوط الخلايا ستابلي التي خضعت لاختيار التكامل الجينوم يمكن أن يحقق عائدات أعلى. ارتفاع كميات البروتين تسمح للتنمية فحص المتعلقة في المختبر توصيف ويمكن أن توفر مؤشرا على نوعية الأجسام المضادة في الاعتبار لتطبيقات المصب مثل خط خلية نسيلي والرائدة اختيار المرشحين.

والهدف من هذه المقالة هو لوصف التعبير مستقر وتنقية الأجسام المضادة العلاجية التي تنتج في نظام التعبير الثدييات. في الواقع، يمكن تطبيق هذه الطريقة للتعبير عن الأجسام المضادة بدائل حيوية. ويمكن استخدام طريقة لتوصيف الأولي من الأجسام المضادة قبل الشروع في لالحرجة، وإن كان الظريف تستغرق وقتا طويلاملاحظة تحديد استنساخ المرغوب فيه التصنيع على نطاق أوسع. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم للتعبير عن البروتينات الأخرى، وليس الأجسام المضادة فقط.

يصف بروتوكول مفصلة التالية التعبير عن تراستوزوماب الأجسام المضادة العلاجية. وهذا يتكون من إعداد الحمض النووي ناقلات تليها ترنسفكأيشن مستقرة في خط خلية كلوة-293 و تنقية البروتين الأجسام المضادة باستخدام أسلوب الكروماتوغرافي الآلي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: يجب استخدام ناقلات التعبير الثدييات مناسبة لهذا البروتوكول. هنا، يتم استخدام بناء واحد يحتوي على اثنين من أشرطة التعبير (أي هو الدافع وراء التعبير سلسلة الثقيلة والخفيفة من قبل المروجين منفصلة). تم استنساخ سلاسل الثقيلة والخفيفة تراستوزوماب سابقا في ناقلات. وكان هذا ناقلات هدية من أندرو Beavil، التي تم الحصول عليها من خلال الأرباح غير هادفة للبلازميد مستودع 13.

1. الإنعاش ومقياس المتابعة من ناقلات الحمض النووي

ملاحظة: كان في استقبال ناقلات الحمض النووي كثقافة طعنة أجار لينة في سلالة كولاي XL-1 الأزرق؛ ناقلات تحمل المقاومة هيغروميسين.

  1. اضافة الى وجود طعنة التلقيح المعقمة أو حلقة في أجار لينة من ثقافة طعنات متتالية ثم لوريا Bertani (LB) لوحة أجار أعدت مع 75 ميكروغرام / مل هيغروميسين للمستعمرات معزولة. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة.
  2. تلقيح مستعمرة واحدة في 5 مل مرق رائع (السل) التي تحتوي على 75 ميكروغرام / مل هيغروميسين. Incuباتي الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة مع 225 دورة في الدقيقة تهتز.
  3. استخدام الثقافة بين عشية وضحاها لإعداد المخزون الجلسرين من الحمض النووي ناقلات عن طريق خلط بلطف 800 ميكرولتر من ثقافة مع 200 ميكرولتر 80٪ الجلسرين في cryovial وتجميد في -80 درجة مئوية.
    1. إضافة 100 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها إلى 100 مل السل التي تحتوي على 75 ميكروغرام / مل هيغروميسين في قارورة شاكر حيرة (أي 1/1000 تمييع). احتضان الثقافة في 37 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة مع 225 دورة في الدقيقة تهتز.
  4. بعد ثقافة بين عشية وضحاها، واستخراج وتنقية الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة من إعداد مجموعة ميدي / ماكسي مع الاستثناء التالي. خلال هذه الخطوة، أزل أو و resuspend الحمض النووي النهائي مع الماء (درجة الحموضة 7،0-8،5).
  5. تحقق التركيز والنقاء من الحمض النووي عن طريق قراءات الامتصاصية في 260 و 280 نانومتر ثم تخزين الحمض النووي في -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: اختياري (يوصى): تسلسل الحمض النووي باستخدام بادئات ناقلات محددة لتأكيد الهوية.

2. ترنسفكأيشن مستقرة من كلوة-293 الخلايا

  1. النمو والحفاظ على كلوة-293 الخلايا (خلايا تعليق) وفقا لبروتوكولات موحدة في وسائل الإعلام المصل خالية تستكمل مع 0.1٪ السطحي غير الأيونية في قوارير زجاجية أخرى. الحفاظ على 2 × 10 5 خلية / مل وثقافة فرعية كل يوم الرابع. ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 و 120 دوران دورة في الدقيقة.
    كان ينبغي أن يكون خلايا في الثقافة لمدة لا تقل عن 4 أيام وقبل ما لا يزيد عن 4 أسابيع لترنسفكأيشن: ملاحظة. ويمكن أيضا كلوة-293 الخلايا كما نمت الطبقات الوحيدة في وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل أن تستخدم لهذا الإجراء.
  2. في اليوم قبل ترنسفكأيشن والبذور كلوة-293 الخلايا في 3 × 10 5 خلية / مل في الآبار من لوحة ال 12 أيضا في 2 مل من Dulbecco لتعديل النسر وسائل الإعلام (DMEM) تستكمل مع 10٪ للحرارة المعطل مصل بقري جنيني ( FBS). يوم ترنسفكأيشن، تأكد من أن الخلايا قد وصلت 80-90٪ confluency
  3. تخفيف الحمض النووي وpolyethylenimine (PEI) على حدة في وسائل الإعلام ترنسفكأيشن ثم تخلط معا.
    1. تمييع 1.25 ميكروغرام ناقلات الحمض النووي لكل بئر (15 ميكروغرام لمدة 12 بئرا) في 300 وسائل الإعلام ترنسفكأيشن ميكرولتر. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    2. تمييع 2.5 ميكرولتر من 1 ملغ حل / مل جزيرة الأمير إدوارد (30 ميكرولتر لمدة 12 بئرا، أي 1: 2 نسبة الحمض النووي لجزيرة الأمير إدوارد) في 300 وسائل الإعلام ترنسفكأيشن ميكرولتر. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    3. إضافة الحمض النووي المخفف إلى المخفف جزيرة الأمير إدوارد، مزيج بلطف واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  4. إضافة 50 ميكرولتر من الحمض النووي / جزيرة الأمير إدوارد خليط قطرة قطرة إلى كل بئر من لوحة. صخرة لوحة بلطف لتوزيع الخليط ترنسفكأيشن ثم وضع لوحة في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة.
  5. إضافة 50 ميكروغرام / مل هيغروميسين B لكل بئر والعودة لوحة إلى 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 10 يوما.
    ملاحظة: قبل يوم 10، سيكون قد مات خلايا الامم المتحدة وtransfected وفصل من سطح اللوحة، في حين أن الخلايا ستابلي، ستكون قادرة على البقاء وتعلق على لوحة.
  6. استبدال وسائل الإعلام في الآبار مع1/4 حجم وسائل الإعلام الحرة المصل و3/4 حجم DMEM تستكمل مع FBS 10٪ (أي 0.5 مل سائل الإعلام الحرة المصل + 1.5 مل DMEM = 7.5٪ تركيز مصل النهائي)، واحتضان لمدة 4 أيام.
  7. استبدال وسائل الإعلام في الآبار مع 1/2 حجم وسائل الإعلام الحرة المصل و1/2 حجم DMEM تستكمل مع FBS 10٪ (أي وسائل الإعلام الحرة المصل 1 مل + 1 مل DMEM = 5٪ تركيز مصل النهائي)، واحتضان لمدة 4 أيام.
  8. استبدال وسائل الإعلام في الآبار مع 3/4 حجم وسائل الإعلام الحرة المصل و1/4 حجم DMEM تستكمل مع FBS 10٪ (أي 1.5 مل سائل الإعلام الحرة المصل + 0.5 مل DMEM = 2.5٪ تركيز مصل النهائي)، واحتضان لمدة 4 أيام.
  9. استبدال وسائل الإعلام في الآبار مع 2 مل من وسائل الاعلام المصل خالية تستكمل مع 0.1٪ غير الأيونية بالسطح (تركيز مصل النهائي 0٪ أي)، واحتضان لمدة 4 أيام.
    ملاحظة: الحفاظ على 50 ميكروغرام / مل هيغروميسين B ضغط انتقائي على الخلايا خلال التكيف خالية من المصل. خلايا تتكيف مع وسائل الإعلام الحرة المصل فصل من سطح الآبار وقد تتجمع طن تعليق. الرجوع إلى الخطوة 2.1 لظروف التربية مع ملحق إضافي من 50 ميكروغرام / مل هيغروميسين B.
  10. باستخدام ماصة، المزيج بلطف الثقافات تعليق في الخلايا لوحة وتجمع ال 12 أيضا في أنبوب منفصل.
    1. باستخدام عدادة الكريات، تعداد خلايا المجمعة والبذور في 30 مل سائل الإعلام خالية من المصل في دورق مخروطي في 2 × 10 5 خلية / مل. ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 و 120 دوران دورة في الدقيقة. ثقافة فرعية وتوسيع كل يوم الرابع.
  11. مواصلة توسيع حجم الثقافة لكثافة الخلايا المطلوبة للحصول على 10 قارورة في 1 × 10 7 خلايا / قارورة لحفظ البرودة في النيتروجين السائل. تجميد الخلايا في وسائل الإعلام المصل خالية تحتوي على 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
    ملاحظة: مكيفة وسائل الإعلام التي تحتوي على الأجسام المضادة يمكن أن تحصد في كل ثقافة فرعية لتأكيد إنتاج البروتين أو استخدامها لتحسين الظروف تنقية. حصاد سائل الإعلام مكيفة والحفاظ على الخلايا لثقافة فرعية، الطرد المركزي الثقافة في300 x ج لمدة 5 دقائق ثم يصفى تعقيم طاف من خلال مرشح 0.22 ميكرون. يجوز إبقاء طاف تصفيتها عند 4 درجة مئوية لمدة 1-2 أسابيع أو -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.

3. على نطاق واسع جسم إنتاج من دفعة اكتسى الثقافة

ملاحظة: يمكن اتباعها إنتاج الأجسام المضادة على من الخطوة 2.11 حيث يتم توسيع الخلايا الموجودة لكثافة الخلايا المطلوبة على أساس دفعة حجم ثقافة اكتسى أن يكون الإعداد. خلاف ذلك، والخلايا التي تم إذابة من الحفظ بالتبريد تبدأ في هذه المرحلة مرة واحدة موسعة لكثافة الخلية المناسبة والحجم. ويمكن استخدام المكملات ثقافة مختلفة لتحسين إنتاج الأضداد. استخدام تريبتون لزيادة يتجلى العائد الأجسام المضادة في هذا البروتوكول.

  1. خلايا البذور في 2 × 10 5 خلية / مل في وسائل الإعلام الحرة المصل 100 مل في اثنين من قوارير مخروطي (للمقارنة بين عائدات الضد من ثقافات الامم المتحدة وتستكمل وتستكمل المواد الغذائية). الثقافة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 و 120 دورة في الدقيقة.
  2. بعد 24 ساعة، إضافة تريبتون إلى تركيز النهائي من 0.5٪ إلى ثقافة تستكمل المغذيات. تعادل حجم ثقافة تستكمل الامم المتحدة مع وسائل الإعلام خالية من المصل.
  3. من يوم 8، نفذ عدد الخلايا من الثقافات يوميا باستخدام عدادة الكريات لمراقبة سلامة الخلية. حصاد supernatants الثقافة مرة واحدة بقاء الخلية أقل من 80٪.
    1. حصاد طاف بواسطة الطرد المركزي من الثقافات في 3000 x ج لمدة 15 دقيقة ثم يصفى تعقيم طاف (التي تحتوي على الأجسام المضادة) من خلال مرشح 0.22 ميكرون. تخزين supernatants في 4 درجات مئوية (قصيرة الأجل) أو تجميد في -20 درجة مئوية (على المدى الطويل).

4. الأجسام المضادة تنقية من الانجذاب اللوني باستخدام الآلي البروتين سريع اللوني السائل نظام (FPLC)

ملاحظة: عموما يمكن أن يطبق الإجراء التالي على أكثر الأنظمة الآلية. تنقية لا يمكن أن يؤديها في درجة حرارة الغرفة أو في 4 درجات مئوية (إذا كان يتم الاحتفاظ نظام FPLC في غرفة باردة).سلسلة من الاختبارات الكشفية لا يمكن أن يؤديها لتحديد الظروف المثلى لتنقية بما في ذلك مصفوفة الأعمدة المناسبة، العازلة، شطف العازلة ودرجة الحموضة ملزمة لضمان استرداد الحد الأقصى من الأجسام المضادة تنقيته من وسائل الإعلام مكيفة (يرجى الرجوع إلى قسم النتائج). الظروف المثلى تعتمد على الأجسام المضادة أو البروتين يجري تنقيتها. أجريت التنقيات على نظام FPLC الآلي. أجريت التنقيات في درجة حرارة الغرفة باستخدام البروتين 5 مل عمود.

  1. إعداد مخازن التالية باستخدام الماء عالى النقاء والتكيف مع درجة الحموضة أوصى ثم تصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرون.
    1. إعداد 1 لتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ودرجة الحموضة 7.4 (العازلة ملزمة) عن طريق خلط ما يلي: 0.14 M كلوريد الصوديوم، 0.0027 M بوكل، 0.01 م نا 2 هبو 4 و 0.001 M KH 2 PO 4. ضبط درجة الحموضة إذا لزم الأمر قبل تصفية العازلة.
    2. إعداد 500 مل من 0.1 M الجلايسين حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 2.7 (شطف العازلة). ضبط درجة الحموضة قبل تصفية برتقاليإيه.
    3. تجهيز 50 مل من 1 M تريس درجة الحموضة (العازلة تحييد) 9.0.
  2. ضمان كافة الاتصالات السلطة ونظام الاتصالات مع الكمبيوتر مصنوعة. وينبغي أن تكون أجهزة مرئية في برنامج وحدة "نظام التحكم". ومن المقرر ضمان خلية للأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر الطول الموجي. اختياري: معايرة درجة الحموضة متر وإذا كان متصلا واستخدامها.
  3. تزج أنابيب مدخل من A، B ومضخة العينة في الماء عالى النقاء لغسل النظام. تطهير مضخات مع حقنة حالة وجود الهواء في الأنبوب أو اشتباه في الهواء في النظام. يغسل النظام مع المياه من خلال التشغيل اليدوي عن طريق وحدة تحكم النظام أو عبر طريقة تلقائية. نلاحظ أن ضغط، الموصلية، تتبع UV280 ودرجة الحموضة على ثبات وأن الحد الضغط عن العمود لا يتم تجاوز وفقا لمواصفات الشركة الصانعة.
    ملاحظة: شذوذ قد تشير إلى الهواء أو انسداد في النظام التي ينبغي معالجتها قبل المتابعة.
  4. في وحدة تحكم النظام، بدء معدل التدفق في 1مل / دقيقة يدويا عن طريق مضخة وإما في الحمل (تجاوز عينة حلقة) أو حقن (خلال الحلقة العينة) موقف لبدء ربط العمود. أنابيب نظام قطع الاتصال عند مدخل موضع العمود وإزالة سدادة متصلا مدخل عمود.
    1. السماح لتدفق المياه من قطرة قطرة نظام الأنابيب على رأس العمود ثم إرفاق أنابيب نظام إلى العمود. وجود مدخل عمود ومدخل المناسب تفيض مع قطرات من الماء يضمن اتصال خالية من فقاعات الهواء.
  5. إرفاق منفذ عمود في منفذ المصب والتحقق يتم تثبيتها بإحكام جميع التجهيزات. مع العمود تعلق الآن على النظام، لا تتجاوز حدود الحد الأقصى الضغط ومعدل التدفق على النحو المبين في مواصفات العمود.
  6. غسل العمود مع 5 أحجام العمود (CV) من الماء. إذا لزم الأمر، ومواصلة غسل العمود حتى استقر UV280 البحث عن المفقودين.
  7. تزج أنابيب مدخل من ألف في التجليد عازلة، B في شطف العازلة ومضخة العينة في المخزن ر ملزمس تتوازن النظام في مخازن الصحيحة. ملء أنابيب مدخل مع العازلة باستخدام PumpWash من التشغيل اليدوي.
  8. في وحدة في "محرر أسلوب 'من البرنامج، استخدم معالج طريقة لإعداد وسيلة اللوني تقارب للعمود الذي يهدف إلى استخدامها.
    ملاحظة: الأنظمة الأوتوماتيكية لFPLC تأتي مع أساليب ما قبل مليئة الإعدادات الموصى بها (أي معدل التدفق والحد من الضغط) وتشغيل الخطوات بناء على عمود (الصانع، مصفوفة وحجم) التي اختيرت لتنقية.
    1. اتبع الخطوات التالية لتشغيل البروتين واللوني تقارب:
      1. تتوازن النظام مع 5 السيرة الذاتية العازلة ملزمة وجمع flowthrough في حاوية النفايات.
      2. عينة الحمل على العمود (حجم ليتم تحميلها يتم تحديد يدويا في طريقة) وجمع flowthrough في وعاء منفصل.
      3. يغسل النظام مع 5 السيرة الذاتية العازلة ملزمة وجمع flowthrough في وعاء منفصل.
      4. العمود أزل مع isocrat 5 السيرة الذاتيةجيم تجزئة باستخدام شطف العازلة وجمع عينة الأجسام المضادة النقاء كما الكسور جامع الكسر.
      5. تتوازن النظام مع 5 السيرة الذاتية العازلة ملزمة وجمع flowthrough في حاوية النفايات.
  9. مرة واحدة كانت طريقة الإعداد، تحديد حجم وسائل الإعلام مكيفة ليتم تطبيقها على العمود وحفظ الأسلوب.
    ملاحظة: يجب أن يكون حجم المحدد في طريقة 5-10 مل أقل من الحجم الفعلي لتجنب إدخال الهواء أثناء تشغيل العينة. وحدة التخزين المحددة المستخدمة في هذا البروتوكول هو 90-120 مل.
  10. غمر أنابيب ضخ العينة في الإناء الذي يحتوي على وسائل الإعلام مكيفة.
  11. تحضير وعاء منفصل لجمع flowthrough عينة عن طريق الأنابيب منفذ محدد.
    ملاحظة: من المهم لجمع flowthrough في حالة حدوث خطأ أثناء التشغيل أو قدرة ربط العمود تجاوز تتطلب flowthrough إلى إعادة تطبيق إلى العمود أو ص تنقيةepeated.
  12. إعداد أنابيب جمع في جامع الكسر. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة تحييد لكل 1 مل حجم الكسر. سيقوم النظام FPLC أزل تلقائيا الكسور في أنابيب جمع.
  13. في وحدة 'مكافحة النظام' من البرنامج، افتح طريقة ليتم تشغيلها.
    ملاحظة: يتم بدء تشغيل الأسلوب في سلسلة من الصفحات التي تشمل فحص متغيرات طريقة، والإعداد جامع جزء وتحديد اسم الملف نتيجة وموقع التخزين.
  14. انقر فوق ابدأ لبدء التشغيل. ويمكن رصد التشغيل في وحدة 'مكافحة النظام'.
  15. عند الانتهاء من تشغيل تنقية، والتحقق من اللوني مما أسفر عن وحدة 'تقييم' في برنامج النظام.
  16. الجمع بين جميع الكسور التي تحتوي على البروتين في أنبوب، وتبادل عازلة منفصل والتركيز في برنامج تلفزيوني باستخدام جهاز الطرد المركزي فلتر مع 30 كيلو دالتون الوزن الجزيئي قطع. تنفيذ الخطوات الطرد المركزي وفقا لالصانعتعليمات.
  17. قياس تركيز الأجسام المضادة باستخدام فحص الحمض bicinchoninic (BCA) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  18. إذا المدى تنقية آخر هو أن يقوم رئيس وأنابيب ضخ العينة في المخزن ملزمة وكرر الخطوات 4،9-4،14.
  19. عند الانتهاء من يدير تنقية، تزج أنابيب مدخل من A، B ومضخة العينة في الماء عالى النقاء ويغسل نظام والعمود كما يؤديها في الخطوة 3.
  20. غمر ألف وباء وعينة مضخة الأنابيب في 20٪ من الإيثانول وتكرار إجراء غسيل للتخزين للنظام والعمود.
  21. فصل عمود من منفذ المصب واستبدال العمود سدادة، ثم قطع عمود في مدخل واستبدال سدادة، إعادة أنابيب إلى النظام. تخزين العمود في 4 درجات مئوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وأكد إنتاج مستقر من تراستوزوماب التي كتبها transfected خلايا كلوة-293 باستخدام التداخل طبقة الحيوي (BLI) على النحو المبين في الشكل 1. تم إنشاء منحنى قياسي مفتش عن طريق قياس معدل ملزم بين مستوى الأجسام المضادة مفتش والبروتين وجهاز الاستشعار البيولوجي (الشكل 1A). تم قياس عينة طاف الخام على نحو مماثل، ثم تركيزه محرف من المنحنى القياسي (الشكل 1B). وقد تم قياس تركيز طاف إلى أن ما يقرب من 25 ميكروغرام / ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تفاصيل هذا البروتوكول ترنسفكأيشن والتعبير مستقر وتنقية الأجسام المضادة العلاجية في كلوة-293 الخلايا. التعبير مستقر للجينات الجسم المضاد هو الخطوة الأولى في توليد خط الخلية المنتجة للأجسام المضادة لتطوير وتصنيع الأجسام المضادة العلاجية. في حين الصيني الهامستر المبيض (CHO) خلايا تظل منصة التعبير المفضل للالبروتينات العلاجية، خط خلية كلوة-293 تكتسب أهمية مع إدراك أن البروتينات التي تنتج في هذه الخلايا هي مباراة أقرب إلى طبيعيا البروتينات البشرية، من حيث مشاركة التعديلات -translationa...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

تم دعم البحث من قبل جامعة سيدني. كان pVITRO1-Trastuzumab-IgG1 / κ هدية من أندرو بيفيل (بلازميد Addgene # 61883). نشكر Tihomir S. Dodev على المناقشات المفيدة فيما يتعلق ب pVITRO1-Trastuzumab-IgG1 / κ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
سلسلة نواقل pFUSEInvivoGenN / Aجينات الأجسام المضادة الثقيلة والخفيفة المعبر عنها في نواقل منفصلة تتطلب تعداء مشتركا.
سلسلة ناقلات mAbXpressACYTE Biotech Pty Ltd.جينات الأجسام المضادة الثقيلة والخفيفة المعبر عنها في نواقل منفصلة تتطلب تعداء مشتركا. الرجوع إلى: جونز ، إم إل وآخرون. طريقة لإعادة التنسيق السريع والمستقل عن الربط للأجسام المضادة أحادية النسيلة المؤتلفة. طرق J المناعية. 354 (1-2) ، 85-90 ، doi: 10.1016 / j.jim.2010.02.001 ، (2010).
ناقل pVITRO1N / AN / Aتشغيل جينات الأجسام المضادة الثقيلة والخفيفة بواسطة محفز منفصل في ناقل واحد. الرجوع إلى: Dodev, T. S. et al. مجموعة أدوات للاستنساخ السريع والتعبير عن الأجسام المضادة المؤتلفة. ممثل العلوم 4 5885 ، دوي: 10.1038 / srep05885 ، (2014).
سلسلة ناقلات GSناقلات لونزامتعددة السيسترونيك مع جينات الأجسام المضادة الثقيلة والخفيفة التي يتم التعبير عنها وترجمتها كنسخة واحدة.
سلسلة ناقلات متعددة السترونيك 1N / AN / Aناقل متعدد السترونيك مع جينات الأجسام المضادة الثقيلة والخفيفة التي يتم التعبير عنها وترجمتها كنسخة واحدة. الرجوع إلى: Li، J. et al.< / em> دراسة مقارنة لتصميمات النواقل المختلفة للتعبير الثديي عن الأجسام المضادة IgG المؤتلفة. طرق J المناعية. 318 (1-2) ، 113-124 ، doi: 10.1016 / j.jim.2006.10.010 ، (2007).
سلسلة ناقلات متعددة السيسترونيك 2N / AN / Aناقل متعدد السترونيك مع جينات الأجسام المضادة الثقيلة والخفيفة التي يتم التعبير عنها وترجمتها كنسخة واحدة. الرجوع إلى: Ho ، S. C. et al.< / em> نواقل التريكسترونيك بوساطة IRES لتعزيز توليد الأجسام المضادة أحادية النسيلة العالية التي تعبر عن خطوط خلايا CHO. ي Biotechnol. 157 (1) ، 130-139 ، doi: 10.1016 / j.jbiotec.2011.09.023 ، (2012).
pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κAddgene61883ناقل تعبير الثدييات الذي يحتوي على جينات الأجسام المضادة trastuzumab مع جين مقاومة hygromycin ؛ pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&kappa ؛ كان هدية من أندرو بيفيل.
Fast-Media Hygro AgarJomar Life Researchfas-hg-sتستخدم لتحضير أجار LB منخفض الملح يحتوي على 75 & micro; جم / مل هيجروميسين.
Fast-Media Hygro TBJomar Life Researchfas-hg-lيستخدم لتحضير مرق السل منخفض الملح الذي يحتوي على 75 & جم / مل هيغرومايسين. 
الجلسرين ، BioXtra ، & ge 99٪سيجما ألدريتشG6279استعد إلى 80٪ بالماء والأوتوكلاف. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
Jestar 2.0 / LFU Plasmid Maxi KitAstral ScientificG221020Plasmid Maxi Prep Kit ؛ قم بإزالة أو إعادة تعليق الحمض النووي في الماء (الرقم الهيدروجيني 7.0-8.5).
FreeStyle 293-F CellsLife TechnologiesR790-07HEK-293 خط خلية تتكيف مع ثقافة التعليق في الوسائط الخالية من المصل.
FreeStyle 293 Expression MediumLife Technologies12338-018وسائط خالية من المصل مصممة خصيصا للحفاظ على خط الخلايا 293-F والتعبير عالي البروتين.
Kolliphor P188Sigma-AldrichK4894خافض للتوتر السطحي غير أيوني ؛ المتعدد F-68 ؛ تحضير 10٪ في الماء وتعقيم الترشيح باستخدام 0.22 & mu ؛ مرشح م. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
DMEM, ارتفاع نسبة الجلوكوز Life Technologies11995-065
تقنيات مصل الجنين البقري المعطلة بالحرارة10082-147
بولي إيثيلينيمين, خطي, MW 25,000 Polysciences، Inc.23966تحضير 1 ملغم/مل في الماء. اضبط على درجة الحموضة 7.0 مع 1 M HCl (يصبح المحلول واضحا) وقم بتعقيمه باستخدام 0.22 & mu ؛ مرشح م. يخزن في -80 درجة ؛ ج حتى الاستخدام.
OptiPro SFMLife Technologies12309-050الوسائط الخالية من المصل المصنوعة
Hygromycin B SolutionJomar Life Researchant-hg-1
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)Thermo Fisher ScientificAJA2225
Tryptone (الكازين البيبتون)Thermo Fisher ScientificLP0042Bالاستعداد إلى 20٪ في PBS وتعقيم الترشيح باستخدام 0.22 مو ؛ مرشح م. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية
أقراص محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، درجة الحموضة 7.4 ، 100 ملAstral Scientific09-2051-100
HiTrap Protein A عالي الأداء ، عمود 1 × 5 ملSigma-AldrichGE17-0403-01
AKTApurifier 100GE Healthcare28406266نظام FPLC الآلي ، والذي يمكن أن يشمل مضخة عينات P-960 ومجمع كسور Frac-920.
Glycine-HClSigma-AldrichG2879
حامض الستريك ، أحادي الهيدراتBIOC2123سترات
الصوديوم العلمية ، ثنائي هيدرات ملح ثلاثي الصوديوم   ؛BIOCB0035Astral Scientific
Tris-HCl ، درجة الحموضة 9.0أيكون
النجمية العلمية (30 MWCO)Merck MilliporeUFC803008 / UFC903008تستخدم للتخزين المؤقت للبروتين المنقى والتبادل وتركيزه.
بيرس حمض البيسينشونيك (BCA) مجموعة الفحصالحرارية فيشر العلمية23227
BLItz Systemfort&ecute; BIO45-5000أداة تستخدم لقياسات قياس تداخل الطبقة الحيوية (BLI).
بروتين A أجهزة الاستشعار الحيويةforté BIO18-5010
أكريلاميد / بيساكريلاميد (37.5: 1) ، محلول 40٪Astral Scientific786-502
بيرسلفات الأمونيوم (APS)AstralScientificAM0486
TEMEDAstral ScientificAM0761
Coomassie Brilliant Blue R-250Astral Scientific786-498
Precision Plus بروتين ثنائي اللون 1610374القياسية Bio-Rad
يتم من الخليط محلول مرشحات الطرد المركزي BIOSD8146

المراجع

  1. Nelson, A. L., Reichert, J. M. Development trends for therapeutic antibody fragments. Nat Biotechnol. 27 (4), 331-337 (2009).
  2. Drake, P. M., Rabuka, D. An emerging playbook for antibody-drug conjugates: lessons from the laboratory and clinic suggest a strategy for improving efficacy and safety. Curr Opin Chem Biol. 28, 174-180 (2015).
  3. Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Bispecific antibodies. Drug Discov Today. 20 (7), 838-847 (2015).
  4. Beck, A., Wurch, T., Bailly, C., Corvaia, N. Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies. Nat Rev Immunol. 10 (5), 345-352 (2010).
  5. Food and Drug Administration. 22, Food and Drug Administration. eds U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), & Center for Biologics Evaluation and Research (CBER) (2015).
  6. European Medicines Agency. 13, European Medicines Agency. eds European Medicines Agency (EMA) & Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) (2014).
  7. Lopez-Morales, C. A., et al. Physicochemical and biological characterization of a biosimilar trastuzumab. Biomed Res Int. 2015, 427235(2015).
  8. Jung, S. K., et al. Physicochemical characterization of Remsima. MAbs. 6 (5), 1163-1177 (2014).
  9. Visser, J., et al. Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab. BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).
  10. Li, J., et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124 (2007).
  11. Fitzgerald, K. D., Semler, B. L. Bridging IRES elements in mRNAs to the eukaryotic translation apparatus. Biochim Biophys Acta. 1789 (9-10), 518-528 (2009).
  12. Ho, S. C., et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139 (2012).
  13. Dodev, T. S., et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4, 5885(2014).
  14. Walsh, G. Post-translational modifications of protein biopharmaceuticals. Drug Discov Today. 15 (17-18), 773-780 (2010).
  15. Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), 96(2008).
  16. Bebbington, C. R., et al. High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker. Biotechnology (N Y). 10 (2), 169-175 (1992).
  17. Kaufman, R. J., et al. Coamplification and coexpression of human tissue-type plasminogen activator and murine dihydrofolate reductase sequences in Chinese hamster ovary cells. Mol Cell Biol. 5 (7), 1750-1759 (1985).
  18. Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
  19. Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 90 (3), 332-344 (2005).
  20. Pham, P. L., et al. Large-scale transient transfection of serum-free suspension-growing HEK293 EBNA1 cells: peptone additives improve cell growth and transfection efficiency. Biotechnol Bioeng. 84 (3), 332-342 (2003).
  21. Yang, W. C., et al. Addition of valproic acid to CHO cell fed-batch cultures improves monoclonal antibody titers. Molecular Biotechnology. 56 (5), 421-428 (2014).
  22. Backliwal, G., et al. Valproic acid: a viable alternative to sodium butyrate for enhancing protein expression in mammalian cell cultures. Biotechnol Bioeng. 101 (1), 182-189 (2008).
  23. Jiang, Z., Sharfstein, S. T. Sodium butyrate stimulates monoclonal antibody over-expression in CHO cells by improving gene accessibility. Biotechnol Bioeng. 100 (1), 189-194 (2008).
  24. Jordan, M., Wurm, F. Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate. Methods. 33 (2), 136-143 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

إنتاج الأجسام المضادة العلاجيةالخط الخلوي HEK-293عفن مستقرعفن بواسطة البولي إيثيلين إيمينالتكيف مع الوسط الخالي من المصلكروماتوغرافيا الألفةالتنقية باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء ذات التدفق السريع (FPLC)قياس حصيلة الأجسام المضادةتبادل المنظمقياس التداخل في الطبقة الحيوية
مختبر إنتاج مقياس وتنقية من الأجسام المضادة العلاجية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.