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방법 논문

실험실 규모의 생산과 치료 용 항체의 정제

17.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55153

⸱

2017년 1월 24일

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Pharmacy, University of Sydney

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 포유 동물 발현 시스템에서의 치료 용 항체의 생산을 설명한다. 설명하는 방법은 친 화성 크로마토 그래피를 사용하여 대규모 문화와 정화의 설정 벡터 DNA, 안정적인 형질 전환 및 인간 배아 신장 293 세포주의 무 혈청 적응의 준비를 포함한다.

초록

치료용 항체의 성공적인 생산은 개발 프로세스 초기부터 시작됩니다. 첫 번째 단계는 항체 유전자의 벡터 발현에 이어 적절한 세포주에 안정적으로 transfection하는 것입니다. 안정한 클론은 원하는 생산 및 성장 특성을 가진 클론을 선택하기 위해 스크리닝을 실시합니다. 이것은 프로세스에서 시간이 많이 걸리지만 중요한 단계입니다. 이 프로토콜은 치료용 항체 발현을 위한 항체 염기서열의 벡터 선택 및 소싱을 고려합니다. 이 방법은 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 인간 배아 신장 293(HEK-293) 세포주의 현탁 변이체의 안정적인 transfection을 위한 벡터 DNA의 준비를 설명합니다. 세포는 transfection 효율을 극대화하기 위해 혈청 함유 배지에서 부착 세포로 transfection되고, 그 후 serum-free 조건에 적응합니다. 대규모 생산, 배치 과성장 배양으로 설정되는 것은 자동화된 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC) 기기를 사용하여 친화성 크로마토그래피로 정제된 항체 단백질을 생산하는 데 사용됩니다. 이 방법에 의해 생성된 항체 수율은 항체의 초기 특성화를 시작하기에 충분한 단백질을 제공할 수 있습니다. 여기에는 체외 분석 개발 또는 물리화학적 특성화가 포함될 수 있으며, 이는 선도 물질 후보 물질에 대한 클론 스크리닝의 시간 소모적인 작업을 지원합니다. 이 방법은 바이오시밀러 항체 생산을 위한 발현 시스템 개발로 이전할 수 있습니다.

서론

치료 용 항체의 성공은 차세대 치료제의 물결이 시작으로 항체 개발에 상당한 투자를 구동하기 위해 계속된다. 항체 시장은 유리한 속성 4 항체 단편 1 항체 - 약물 접합체 (2) 특이 적 항체 (3)과 조작 항체로 재 성형 될 것으로 예상된다. 제약 관심을 얻고 또 다른 클래스는 바이오시 밀러입니다. 바이오시 밀러 항체는 이미 규제 당국의 승인을받은 치료 항체의 제품을 복제 '매우 유사한'이다. 제안 된 바이오시 밀러는 구조, 기능, 동물 독성, 임상 적 안전성과 유효성, 인간의 약동학 (PK), 약력학 (PD) 및 면역 원성 5, 6에 대한 송신자 항체와 비교해야합니다.

승인 연구바이오시 밀러 항체의 ATES 인해 제품의 최종 품질에 엄격한 제약으로 느린왔다. 이러한 최종 처리 단계에 이르기 세포주 및 배양 조건과 정확히 특정 제조 공정 독자적인 남아있을 수있다. 무엇보다, 항체의 제조는 본질적으로 매우 유사한 제품을 생산하는 도전에 추가 할 수있는 변화의 정도를 포함한다. 포괄적 물리 및 생물 리 학적 특성화 및 비교는 매우 곤란하고, 또 밀러 항체의 특성을 입증하는 연구들이 문헌 7, 8, 9에 나타나고있다.

치료 항체를 생성하는 것은 각각의 항체 유전자를 운반하는 벡터를 포유 동물 숙주 세포의 형질 감염과 함께 시작된다. 벡터 디자인, 세포주 및 배양 조건은 예를 설정하기위한 주요 고려 사항은Pression의 시스템입니다.

항체의 DNA 서열은 약 은행 (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) 또는 특허 공보를 포함한 연구에서 공급 될 수있다. 예를 들어, 트라 스투 주맙의 순서는 약물 은행 (: DB00072 DB의 ID)를 통해 사용할 수 있습니다. 가변 영역의 아미노산 서열은 바람직한 숙주 종에서 합성 유전자의 디자인 및 최적화를 겪을 수있다. 그것은 더 변형되는 아미노산 서열로 이루어지지 않은 밀러 항체 중요하다. 합성 후, 항체 유전자는 선택의 적절한 벡터 내로 클로닝 할 수있다.

인간 IgG 항체는 두 개의 동일한 중쇄 2 개의 동일한 경쇄로 구성되어 있습니다. 두 체인의 단단히 규제 발현은 포유류 세포 (10)의 이종의 IgG 단백질의 최적 생산을 위해 필수적이다. 사슬 간 이황화 결합을 형성 할 수 있고 번역 후 변형의 개수에 있어야 할뿐만 아니라 인트라단백질 생합성 동안 scaling과 shearing. 벡터의 수는 항체 유전자 (재료의 표 참조) 표현하기 위해 특별히 설계되었습니다이 가능합니다. 이 항체 고유 벡터는 일반적으로 각 체인 그렇게 만 가변 영역 복제를 필요로 무거운 가벼운 모두 체인의 일정 영역을 표현한다.

두 개의 독립적 인 구조 (공동 트랜)와 세포의 형질 감염은 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자를 전달하기위한 가장 일반적인 방법이다. 즉, 각각의 유전자가 소포체에 조립되기 전에 자신의 프로모터에 의해 구동되는 분리 된 항체 사슬로 전사된다. 한편, 멀티 cistronic 벡터는 mRNA를 (11)의 내부 영역에서 허용 번역 된 단일의 mRNA 전 사체 여러 유전자의 발현을 허용 혼입 내부 리보솜 진입 사이트 (IRES) 요소를 가지고있다. 이 경우, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자는 ARRANG로 연결된다두 항체 쇄 (10) (12)의 공동 발현을 달성 장담.

일시적으로 형질 감염된 세포는 실험 제한을 수행하기에 충분한 단백질을 수득하지만, 게놈 통합을위한 선택을받은 안정적으로 형질 감염된 세포주는 높은 수율을 제공 할 수있다. 높은 단백질 량은 시험 관내 특성화 관련 분석법 개발을 허용하며 클론 세포주 리드 후보 선택으로 하류 애플리케이션을 고려하여 항체의 품질의 표시를 제공 할 수있다.

이 문서의 목적은 포유 동물 발현 시스템에서 생산 된 치료 용 항체의 안정적인 발현과 정제를 설명한다. 실제로,이 방법은 밀러 항체의 발현에 적용될 수있다. 이 방법은 시간이 많이 소요 인트이라도 임계로 진행하기 전에 항체의 초기 특성에 사용될 수있다대규모 생산을위한 바람직한 클론을 식별 PS. 또한,이 방법은 다른 단백질뿐 아니라 항체를 발현하는데 사용될 수있다.

상세한 프로토콜은 치료 용 항체 트라 스투 주맵의 발현을 설명한다. 이 자동화 된 크로마토 그래피 방법에 의해 HEK-293 세포주 및 항체 단백질의 정제 안정한 형질 뒤에 벡터 DNA의 준비로 구성된다.

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프로토콜

주 : 적절한 포유 동물 발현 벡터는이 프로토콜을 사용해야합니다. 여기서, 두 발현 카세트를 포함하는 하나의 구조가 사용되는 (즉, 중쇄 및 경쇄 발현 별도 프로모터에 의해 구동된다). 트라 스투 주맵 중쇄 및 경쇄 이전 벡터에 클로닝 하였다. 이 벡터는 비영리 플라스미드 저장소 (13)를 통해 얻은 앤드류 Beavil의 선물이었다.

1. 복구 및 벡터 DNA의 스케일 업

참고 : 벡터 DNA가 대장균 XL-1 블루 균주에 부드러운 한천 자상 문화로받은; 벡터는 하이 그로 마이신 내성을 전달한다.

  1. 다음 질주 루리아 베르 타니 (LB) 한천 플레이트는 75 μg의로 제조 된 자상 문화의 부드러운 한천로 멸균 접종 자상 또는 루프를 삽입 / 격리 식민지에 대한 하이 그로 마이신 ㎖로. 18 ~ 24 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어.
  2. 75 μg의 / ㎖ 하이 그로 마이신을 함유하는 5 ㎖의 좋아요 국물 (TB)로 단일 식민지의 예방. 인큐225 rpm으로 떨고에 18 ~ 24 시간 동안 37 ° C에서 BATE 문화.
  3. 부드럽게 -80 ° C에서 cryovial 및 동결에 200 ㎕의 80 % 글리세롤과 문화의 800 μl를 혼합하여 벡터 DNA의 글리세롤 주식을 준비하기 위해 야간 문화를 사용합니다.
    1. 포함 된 100 ml의 TB에 하룻밤 문화의 100 μl를 추가 75 μg의가 / 당황 진탕 플라스크 (즉, 1 / 1,000 희석)에서 하이 그로 마이신 ㎖로. 225 rpm으로 진탕으로 18 ~ 24 시간 동안 37 ° C에서 문화를 품어.
  4. 하룻밤 배양 한 후, 추출하여 다음과 같은 예외와 미디 / 맥시 준비 키트의 제조 업체의 지시에 따라 DNA를 정화; 물 (PH 7.0-8.5)와 마지막 단계, 용출 또는에 resuspend DNA 동안.
  5. 다음 -20 ° C에서 DNA를 저장 260, 280 nm의 농도와 흡광도 측정에 의한 DNA의 순도를 확인합니다.
    참고 : 선택 사항 (추천) : 시퀀스 DNA 신원을 확인하기 위해 벡터 특이 프라이머를 사용하여.

이. HEK-293 세포의 안정적인 형질

  1. 성장 삼각 플라스크에 0.1 % 비이 온성 계면 활성제로 보충 된 무 혈청 배지에서 표준 프로토콜에 따른 HEK-293 세포 (세포 현탁액)을 유지한다. 2 × 105 세포 / ml 및 계대마다 넷째 날에 유지한다. 5 % CO 2, 120 rpm으로 회전 37 ° C에서 배양 세포.
    참고 : 세포는 더 적은 4 일 이상 배양하고 및 형질 전환없이 4 주 이상 전에해야합니다. 혈청 - 함유 배지에서 단층으로 성장 된 HEK-293 세포는이 절차에 사용될 수있다.
  2. 날에 형질 감염 전에, 씨드 HEK-293 세포로 12 웰 플레이트의 웰에서 3 × 105 세포 / ml의 2 내지 10 %의 열 - 불 활성화 소 태아 혈청이 보충 된 둘 베코 변형 이글 매체 (DMEM)의 ㎖ ( FBS). 형질의 날, 세포 80-90%의 포화 상태에 도달했는지 확인
  3. 다음 함께 혼합 형질 미디어에서 별도로 DNA와 폴리에틸렌 이민 (PEI)를 희석.
    1. 300 ㎕를 형질 미디어에 잘 당 1.25 μg의 벡터 DNA (12 우물 15 μg의)를 희석. 실온에서 5 분간 인큐베이션.
    2. (12 우물 30 μL, 즉 1 : PEI에 DNA의 2 비율) 1 ㎎ / ㎖ PEI 솔루션의 2.5 μl를 희석하여 300 ㎕를 형질 미디어를. 실온에서 5 분간 인큐베이션.
    3. 부드럽게 섞어 실온에서 15 분 동안 품어 희석 PEI에 희석 DNA를 추가합니다.
  4. 플레이트의 각 웰에 DNA / PEI 혼합 적가의 50 μl를 추가합니다. 24 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2의 형질 전환 혼합물을 다음 플레이트를 배치 분배 부드럽게 플레이트 락.
  5. 물론 당 B를 하이 그로 마이신과 10 일 동안 37 ° C, 5 % CO 2 판을 반환 ㎖ / 50 μg의 추가.
    참고 : 안정적으로 형질 세포가 가능한 플레이트에 부착 될 것입니다 반면 10 일째으로 취소 형질 세포, 판의 표면 사망과 분리 된 것입니다.
  6. 와 우물에서 미디어를 교체1/4 볼륨 혈청이없는 미디어 및 3/4 볼륨 DMEM 10 % FBS (즉, 0.5 ㎖의 혈청이없는 미디어 + 1.5 ml의 DMEM = 7.5 % 최종 혈청 농도)과 4 일 동안 배양으로 보충.
  7. 10 % FBS (+ 1 ml의 DMEM = 5 % 최종 혈청 농도 즉, 1 ㎖의 혈청이없는 미디어)로 보충 1/2 볼륨 혈청이없는 미디어 및 1/2 볼륨 DMEM으로 우물에서 미디어를 교체하고 4 일 동안 배양한다.
  8. 10 % FBS (즉, 1.5 ml의 무 혈청 미디어 + 0.5 ml의 DMEM = 2.5 % 최종 혈청 농도)로 보충 3/4 볼륨 혈청이없는 미디어 및 1/4 볼륨 DMEM으로 우물에서 미디어를 교체하고 4 일 동안 배양한다.
  9. 0.1 % 비 이온 계면 활성제 (즉, 0 % 최종 혈청 농도)로 보충 혈청이없는 미디어의 2 ml의 우물에서 미디어를 교체하고 4 일 동안 배양한다.
    참고 : 무 혈청 적응하는 동안 세포에 50 μg의 / ㎖ 하이 그로 마이신 B 선택적 압력을 유지한다. 혈청이없는 매체에 적응 세포는 우물의 표면에서 분리하고 난 클러스터 수있다n 개의 서스펜션. 50 μg의의 추가 보충와 배양 조건에 대한 2.1 단계를 참조하십시오 / B를 하이 그로 마이신 ㎖로
  10. 피펫을 사용하여 부드럽게 별도의 튜브로 12 웰 플레이트와 풀 세포에서 서스펜션 문화를 섞는다.
    1. 혈구를 사용하여 2 × 105 세포 / ml에서의 삼각 플라스크에 30 mL의 무 혈청 배지에서 세포를 모으고 종자 열거. 5 % CO 2, 120 rpm으로 회전 37 ° C에서 배양 세포. 하위 문화와 모든 넷째 날 확장합니다.
  11. / 1 × 10 7 세포에 10 병을 얻기 위해 필요한 세포 밀도에 문화의 크기를 확장 액체 질소에 냉동 보존을위한 유리 병 계속합니다. 10 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)를 함유하는 무 혈청 배지에서 세포를 동결.
    주 : 항체를 함유 된 배지는 단백질 생산을 확인하는 각 계대에서 수확 또는 정제 조건을 최적화하는데 이용 될 수있다. 에어컨 미디어를 수확하고 계대 배양을위한 세포 유지에 문화를 원심 분리하려면5 분 동안 300 XG은 0.22 μm의 필터로 상청액을 필터 소독. 상등액을 여과 1-2 주 이상 장기 보관 -20 ° C 4 ℃에서 유지 될 수있다.

배치 자라다 문화 3. 대규모 항체 생산

참고 : 항체 생산은 기존의 세포가 설치되도록 배치 자라다 문화 부피를 기준으로 필요한 세포 밀도로 확장하는 단계 2.11에서에 따라 할 수있다. 그렇지 않으면, 냉동 보존에서 해동 된 세포는 한 번 적절한 세포 밀도 및 볼륨 확장이 단계에서 시작합니다. 다양한 배양 보조제는 항체 생산을 최적화하기 위해 사용될 수있다; 트립 톤의 사용은 항체 수율이 프로토콜에 설명된다 증가합니다.

  1. 종자 세포 개의 삼각 플라스크에 100 ㎖의 무 혈청 배지에서 2 × 105 세포 / ml로 (보충-UN 영양 보충 된 배양 물로부터 항체 생산량을 비교). 37 문화 ° C, 5 % CO 2 120 rpm으로.
  2. 24 시간 후, 영양 보충 문화에 0.5 %의 최종 농도 트립 톤을 추가합니다. 혈청이없는 미디어 않은 보충 문화의 볼륨을 균등하게.
  3. 하루 8에서, 세포 생존을 모니터링하는 혈구를 사용하여 매일 문화의 세포 수를 수행합니다. 세포 생존율은 80 % 이하가되면, 배양 상청액을 수확.
    1. 3,000 XG에 15 분에서 문화의 원심 분리하여 수확 뜨는은 0.22 μm의 필터를 통해 뜨는 (포함하는 항체)를 필터 - 소독. 4 ° C (단기)에서 상층 액을 저장 또는 -20 ° C (장기)에 동결.

친 화성 크로마토 그래피 4. 항체 정제 자동화 된 고속 단백질 액체 크로마토 그래피를 사용하여 (FPLC) 시스템

참고 : 다음 절차는 일반적으로 대부분의 자동화 된 시스템에 적용될 수있다. 정제는 상온에서 또는 4 ° C에서 (FPLC 시스템 시원한 방에서 보관되어있는 경우) 될 수있다.정찰 일련의 테스트 (결과 섹션 참조) 조정 배지로부터 정제 된 항체의 최대 복구를 보장하는 버퍼, 용출 버퍼의 pH를 결합 적절한 열 매트릭스를 포함하는 최적의 정제 조건을 식별하기 위해 수행 될 수있다. 최적의 조건은 항체 또는 단백질 정제 된에 따라 달라집니다. 이 정제를 자동 FPLC 체계에서 수행되었다. 정제를 5 ㎖는 단백질의 열을 사용하여 실온에서 수행 하였다.

  1. 초순수를 이용하여하기 완충액을 제조 한 후, 0.22 μm의 필터로 필터링 추천 pH로 조정한다.
    1. 0.14 M 염화나트륨, 0.0027 M의 KCl, 0.01 M 나 2 HPO 4, 0.001 M KH 2 PO 4 : 다음을 혼합하여 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)의 pH 7.4 (결합 완충액) 1 L를 준비합니다. 버퍼를 필터링하기 전에 필요한 경우 산도를 조정합니다.
    2. 0.1 M 글리신 - 염산 pH가 2.7 (용출 버퍼) 500 ml의를 준비합니다. 버프를 필터링하기 전에 산도를 조정어.
    3. 1 M 트리스 산도 9.0 (중화 버퍼) 50 ㎖를 준비합니다.
  2. 만들어진 컴퓨터와 모든 시스템 전원 및 통신 연결을 확인합니다. 장치 소프트웨어 '시스템 관리'모듈에 표시해야한다. 확인 UV 셀은 280 nm 파장으로 설정된다. 선택 사항 : 연결되어 사용되는 경우 pH 측정기를 보정합니다.
  3. 시스템을 씻어 초순수에 A, B 및 샘플 펌프의 입구 관 빠져. 튜브의 공기 시스템의 공기의 의심이있는 경우 주사기 펌프 퍼지. 시스템 제어기를 통해 또는 자동화 된 방법을 통해 수동 조작에 의해 물 시스템을 씻는다. 그 압력, 전도성, UV280 추적 및 pH가 일관성을 유지하고 열에 대한 압력 한계가 제조업체의 사양에 따라 초과하지 않도록 관찰한다.
    참고 : 이상이 진행하기 전에 해결해야 시스템에 공기 또는 차단을 나타낼 수 있습니다.
  4. 시스템 제어기 모듈에서, 하나의 유량을 시작할ml / 분 수동 중 부하의 펌프 A를 통해 (샘플 루프를 우회) 또는 열을 연결하는 시작 위치 (샘플 루프를 통해) 주입. 시스템을 분리 컬럼 위치 입구 배관 및 칼럼 입구에 연결 마개를 제거한다.
    1. 물은 그 칼럼 시스템 튜브를 부착 기둥의 상부에 시스템 튜빙 적하로부터 흐르게. 열 유입을 갖는 입구 피팅 물 방울 넘쳐하면 기포가없는 연결을 보장합니다.
  5. 하류 출구에 열 배출구를 부착하고 모든 피팅이 단단히 고정되어 있는지 확인합니다. 열이 현재 시스템에 연결을 통해 열 사양에 설명 된대로, 최대 압력 제한 및 유량에 대한 제한을 초과하지 않습니다.
  6. 물 5 컬럼 부피 (CV)와 열을 씻으십시오. 필요한 경우 UV280 추적이 안정 될 때까지 열 세척을 계속합니다.
  7. 버퍼 바인딩에서의 입구 튜브를 담가, 용출에 B는 버퍼와 바인딩 버퍼 t의 샘플 펌프올바른 출력 버퍼에서 시스템을 평형. 수동 조작에 의해 PumpWash를 사용하여 버퍼 입구 튜브를 입력합니다.
  8. 소프트웨어의 '입력기'모듈 설치에있어서 마법사를 사용하도록되어 열에 대한 친 화성 크로마토 그래피 방법을 사용한다.
    참고 : 자동 FPLC 시스템은 방법 권장 설정 (즉, 유량 및 압력 제한)이 자동으로 입력 및 정제를 위해 선택한 열 (제조업체, 매트릭스 및 크기)에 따라 단계를 실행 제공됩니다.
    1. 단백질 친 화성 크로마토 그래피에 대해 다음 실행 단계를 사용하여
      1. 바인딩 버퍼 5 CV와 시스템을 평형 및 폐기물 용기에 유체 통과를 수집합니다.
      2. 컬럼 상에로드 샘플과 별도의 용기에 유체 통과를 수집 (볼륨이 방법에서 수동으로 지정로드 할).
      3. 바인딩 버퍼 5 CV 및 씻을 시스템은 별도의 용기에 유체 통과를 수집합니다.
      4. 5 CV의 isocrat와 용출 열용출은 버퍼 및 분수 수집기에 의해 분수로 정제 된 항체 샘플을 수집하여 IC의 분류.
      5. 바인딩 버퍼 5 CV와 시스템을 평형 및 폐기물 용기에 유체 통과를 수집합니다.
  9. 메소드가 설치되면, 조정 배지의 부피는 컬럼에 적용되도록 지정 및 저장 방법.
    참고 :이 방법에 지정된 볼륨이 샘플을 실행하는 동안 공기의 도입을 피하기 위해 실제 용량보다 5 ~ 10 ml의 작아야합니다. 이 프로토콜에서 사용되는 특정 부피는 90-120 ml 인 것을.
  10. 조절 된 미디어가 들어있는 용기에 샘플 펌프 호스 잠수함.
  11. 지정된 출구 배관을 통해 샘플 유체 통과를 수집하기 위해 별도의 용기를 준비합니다.
    주 : 열 또는 정제 R에 다시 적용 할 수있는 유체 통과를 요구 초과 오류가 실행하거나 열 결합능 동안 발생하는 경우의 유체 통과를 수집하는 것이 중요epeated.
  12. 분수 집에서 수집 튜브를 준비합니다. 1 ml의 비율 적당 중화 버퍼의 100 μl를 추가합니다. FPLC 시스템을 자동으로 수집 튜브에 분획을 용출한다.
  13. 소프트웨어의 '제어 시스템'모듈, 상기 방법을 실행하는 열한다.
    주 :이 방법은 실행에있어서, 분획 수집기 설치의 변수를 확인하고 그 결과 파일명과 저장 위치를 ​​정의하는 것을 포함하는 일련의 페이지에 개시된다.
  14. 실행을 시작하려면 시작을 클릭하십시오. 실행은 '시스템 관리'모듈에서 모니터링 할 수 있습니다.
  15. 정제 실행의 완료시, 시스템 소프트웨어에서의 평가 "모듈에서 얻어진 크로마토 그램을 확인한다.
  16. 별도의 튜브로 버퍼 교환 모두 단백질 - 함유 분획을 결합 및 차단 30 kDa의 분자량 원심 필터 장치를 이용하여 PBS로 농축시켰다. 제조업체에 따라 원심 분리 단계를 수행명령.
  17. 제조업체의 지시에 따라 bicinchoninic 산 분석 (BCA)을 사용하여 항체 농도를 측정한다.
  18. 다른 정화 실행이 수행 될 경우, 바인딩 버퍼와 반복의 주요 샘플 펌프 호스는 4.9-4.14 단계를 반복합니다.
  19. 정화 실행 완료시, 초순수에서 A, B 및 샘플 펌프의 입구 튜브를 체험하고 3 단계에서 수행 할 때 시스템과 열을 씻는다.
  20. 시스템 및 열 저장을 위해 20 %의 에탄올과 반복 세척 과정에서 A, B 및 샘플 펌프 호스 잠수함.
  21. 하류 콘센트에서 열을 분리하고 열 마개를 교체 한 후 입구에서 열을 분리하고 마개를 교체, 시스템에 튜브를 다시 연결합니다. 4 ° C에서 열을 저장합니다.

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결과

도 1에 제시된 바와 같이 형질 감염된 HEK-293 세포에 의해 트라 스투 주맙의 안정적인 생산이 바이오 - 층 간섭 (BLI)을 이용하여 확인 하였다. IgG의 표준 곡선은 IgG 항체 표준 단백질 바이오 센서 (도 1a) 사이의 결합 비율을 측정하여 생성 하였다. 조 상등액 시료를 유사하게 측정 한 후, 그 농도는 표준 곡선 (도 1b)에서 보간. 상등액의 농도를 약 25 μg의 / mL로 측정되었다 무 혈청 적응 후 이주 (계대에서 수집 된 50 ㎖에서 채취)과 자라다 배치 배양을위한 셀을 설정하기 전에.

무 혈청 적응 풀링 및 정제 조건을 최적화하기 위해 사용 된 후에, 각 배양 상등액을 수집; 도 2에 도시 된 바와 같이 결합 및...

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토론

이 프로토콜은 HEK-293 세포에 형질 감염 안정 발현 및 치료 용 항체의 정제 사항. 항체 유전자의 안정한 발현은 치료 용 항체의 개발 및 제조에 대한 항체 생산 세포주를 생성하는 첫 번째 단계이다. 중국어 햄스터 난소 (CHO) 세포 치료 용 단백질에 대한 선택의 발현 플랫폼 남아 있지만, HEK-293 세포주 게시물의 측면에서 이들 세포에서 생성 된 단백질이 자연적으로 인간 단백질을 발생하는 가까운 경기입니다 실현으로 명성을 얻고있다 -translational 변형 및 기능 (14), (15).

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 시드니 대학의 지원을 받았습니다. pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ는 Andrew Beavil (Addgene plasmid # 61883)의 선물이었습니다. pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ에 관한 유용한 토론을 해주신 Tihomir S. Dodev에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
pFUSE vector seriesInvivoGenN/Aco-transfection이 필요한 별도의 벡터에서 발현되는 Heavy 및 Light 항체 유전자.
mAbXpress 벡터 시리즈ACYTE Biotech Pty Ltd.co-transfection이 필요한 별도의 벡터에서 발현되는 heavy 및 light 항체 유전자. 참조: Jones, M. L. et al. 재조합 단클론 항체의 신속한 결찰 독립적 재형성 방법. J 면역 방법. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
pVITRO1 벡터N/AN/AHeavy 및 Light 항체 유전자는 각각 단일 벡터에서 별도의 promoter에 의해 구동됩니다.  참고문헌: Dodev, T. S. et al. 재조합 항체의 신속한 클로닝 및 발현을 위한 도구 키트. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
GS vector seriesLonzaMulti-cistronic 벡터는 무거운 항체와 가벼운 항체 유전자가 함께 발현되어 단일 전사체로 번역됩니다.
Multi-cistronic vector series 1N/AN/A무겁고 가벼운 항체 유전자가 단일 전사체로 동시 발현 및 번역된 다중 시스트로닉 벡터. 참고문헌: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies(재조합 IgG 항체의 포유류 발현을 위한 다양한 벡터 설계의 비교 연구). J 면역 방법. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Multi-cistronic vector series 2N/AN/A무겁고 가벼운 항체 유전자가 단일 전사체로 동시 발현 및 번역된 다중 시스트로닉 벡터. 참고문헌: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhance generating of high monoclonal antibody expressing CHO cell line. J 바이오테크놀. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-트라스투주맙-IgG1/&카파;하이드로마이신 내성 유전자를 가진 트라스투주맙 항체 유전자를 포함하는 포유류 발현 벡터인 Addgene 61883; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ는 Andrew Beavil의 선물이었습니다.
Fast-Media Hygro AgarJomar Life Researchfas-hg-s75 µ를 함유 한 저염 LB 한천을 제조하는 데 사용됩니다. g/ml 하이그로마이신.
Fast-Media Hygro TBJomar Life Researchfas-hg-l75 µ를 함유 한 저염 TB 국물을 제조하는 데 사용됩니다. g/ml 하이그로마이신. 
글리세롤, BioXtra, ≥ 99%Sigma-AldrichG6279물과 오토클레이브로 80%까지 준비합니다. 실온에서 보관하십시오.
Jestar 2.0/LFU 플라스미드 맥시 키트Astral ScientificG221020플라스미드 맥시 준비 키트; DNA를 물(pH 7.0-8.5)에서 용출 또는 재현탁합니다.
FreeStyle 293-F CellsLife TechnologiesR790-07HEK-293 세포주는 무혈청 배지에서 현탁 배양에 적합합니다.
FreeStyle 293 Expression MediumLife Technologies12338-018293-F 세포주 및 고단백 발현 유지를 위해 특별히 제조된 무혈청 배지.
Kolliphor P188Sigma-AldrichK4894비이온 성 계면활성제; pluronic F-68; 물에 10%로 준비하고 0.22 &mu를 사용하여 필터 살균; M 필터. 4 °C에 보관하십시오.
DMEM, 고혈당 Life Technologies11995-065
열 비활성화 태아 소 혈청Life Technologies10082-147
폴리에틸렌이민, 선형, MW 25,000 폴리사이언스, Inc.23966물에 1mg/ml를 준비합니다. 1 M HCl로 pH 7.0으로 조정하고(용액이 투명해짐) 0.22 μ를 사용하여 필터 살균합니다. M 필터. -80 °에서 보관하십시오. C를 사용할 때까지.
OptiPro SFMLife Technologies12309-050트랜스펙션 제형 무혈청 매체
하이그로마이신 B 솔루션Jomar Life Researchant-hg-1
디메틸설폭사이드(DMSO)Thermo Fisher ScientificAJA2225
트립톤(카제인 펩톤)Thermo Fisher ScientificLP0042BPBS에서 20%까지 준비하고 0.22 &mu를 사용하여 필터 살균합니다. M 필터. 4 °C.에 보관하십시오. 
인산염 완충 식염수(PBS) 정제, pH 7.4, 100mlAstral Scientific09-2051-100
HiTrap Protein A 고성능, 1 x 5ml 컬럼Sigma-AldrichGE17-0403-01
AKTApurifier 100GE Healthcare28406266P-960 샘플 펌프 및 Frac-920 분획 수집기를 포함할 수 있는 자동 FPLC 시스템.
Glycine-HClSigma-AldrichG2879
시트르산, 단수화물Astral ScientificBIOC2123
시트르산나트륨, 트리소듐 염 이수화물 Astral ScientificBIOCB0035
1M Tris-HCl 용액 pH 9.0Astral ScientificBIOSD8146
Amicon 울트라 원심 필터(30MWCO)Merck MilliporeUFC803008/UFC903008정제된 단백질을 완충, 교환 및 농축하는 데 사용됩니다.
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) 분석 키트Thermo Fisher Scientific23227
BLItz 시스템forté BIO45-5000BLI(생체 층 간섭계) 측정에 사용되는 기기.
단백질 A 바이오센서forté BIO18-5010
아크릴아미드/비사아크릴아미드(37.5:1), 40% 용액Astral Scientific786-502
과황산암모늄(APS)Astral ScientificAM0486
TEMEDAstral ScientificAM0761
Coomassie Brilliant Blue R-250Astral Scientific786-498
Precision Plus 이중 색상 단백질 표준Bio-Rad1610374

참고문헌

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