Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Лабораторные весы Получение и очистка терапевтического антитела

17.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55153

⸱

24 января 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Pharmacy, University of Sydney

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает получение терапевтического антитела в системе экспрессии млекопитающих. Описанные методы включают приготовление векторной ДНК, стабильной трансфекции и адаптации эмбриона человека линии клеток почки 293 без сыворотки, набор из крупных культур и очистки с использованием аффинной хроматографии.

Аннотация

Обеспечение успешного производства терапевтического антитела начинается на ранних этапах процесса разработки. Первым этапом является векторная экспрессия генов антител с последующей стабильной трансфекцией в подходящую клеточную линию. Стабильные клоны подвергаются скринингу с целью отбора клонов с желаемыми характеристиками производства и роста. Это критический, хотя и трудоемкий этап процесса. В этом протоколе рассматривается выбор вектора и поиск последовательностей антител для экспрессии терапевтического антитела. Методы описывают получение векторной ДНК для стабильной трансфекции суспензионного варианта клеточной линии эмбриональной почки 293 человека (HEK-293) с использованием полиэтиленимина (ПЭИ). Клетки трансфицируют в качестве адгезивных клеток в сывороткосодержащие среды для максимизации эффективности трансфекции, а затем адаптируют к условиям без сыворотки. Крупномасштабное производство, организованное в виде культур периодического зарастания, используется для получения белка-антитела, который очищается с помощью аффинной хроматографии с использованием автоматизированного прибора для жидкостной хроматографии быстрого белка (FPLC). Антитела, полученные этим методом, могут обеспечить достаточное количество белка для начала первоначальной характеристики антитела. Это может включать в себя разработку анализа in vitro или физико-химическую характеристику, чтобы помочь в трудоемкой задаче клонального скрининга на наличие кандидатов на ведущие позиции. Этот метод может быть перенесен на разработку системы экспрессии для получения биоподобных антител.

Введение

Успех терапевтических антител продолжает стимулировать значительные инвестиции в развитие антител, как начинается волна терапии следующего поколения. Рынок антител , как ожидается, будет переработанная фрагментами антител 1, антитело-лекарственное средство конъюгатов 2, биспецифические антитела 3 и сконструированных антител с благоприятными свойствами 4. Другой класс приобретает фармацевтический интерес являются биоподобий. Биоподобие антитела являются "очень похожи" реплицировать продукты терапевтического антитела, которое уже получил одобрение регулирующих органов. Предлагаемая биоподобие должна быть сравнима с отправителе антитела по отношению к его структуре, функции животных токсичности, клиническая эффективность и безопасность, человека фармакокинетики (PK), фармакодинамики (PD) и иммуногенности 5, 6.

Утверждение гАтеш из биоподобных антител медленно из-за строгих ограничений на качество конечного продукта. Точные производственные процессы, такие как специфические клеточные линии и условия культивирования до финальных стадий обработки может оставаться частной собственностью. Более того, производство антител, по своей сути предполагает определенную степень изменчивости, которая может добавить к проблеме получения весьма аналогичный продукт. Комплексный физико - химическая и биофизических характеристика и сравнение довольно сложно, но ряд исследований , демонстрирующих характеристики биоподобных антител появляются в литературе 7, 8, 9.

Генерирование терапевтическое антитело начинается с трансфекции клеток-хозяев млекопитающих вектором, несущим гены, для соответствующего антитела. Вектор дизайн, линия клеток и условия культивирования являются ключевыми факторами для создания эксприжимное система.

ДНК-последовательности антител могут быть получены из банка медикаментов (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) или научных публикаций, включая патенты. Например, последовательность трастузумаба доступна через банк лекарственных средств (DB ID: DB00072). Аминокислотная последовательность вариабельных областей могут пройти проектирование и оптимизацию генов для синтеза в желаемых видов хозяев. Это важно для биоподобие антитела, никакие модификации не сделано в аминокислотной последовательности. После того, как синтезирован, гены антител могут быть субклонировали в соответствующий вектор выбора.

Человеческие антитела IgG состоит из двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей. Плотно регулируемую экспрессию обеих цепей имеет важное значение для оптимального производства гетерологичного белка IgG в клетках млекопитающих 10. Внутри- а также дисульфидные связи между цепями должны быть сформированы и ряд посттрансляционных модификаций должны быть вtroduced в процессе биосинтеза белка. Ряд векторов доступны, которые были разработаны специально, чтобы выразить гены антител (см табл материалов). Эти векторы антитела специфичные обычно выражают постоянные области как для тяжелых и легких цепей, так только Вариабельные области каждой цепи требуют клонирования.

Трансфекция клеток с двумя независимыми конструкциями (Котрансфекция) является наиболее распространенным подходом для доставки тяжелых и легких цепей генов, кодирующих. То есть, каждый ген приводится в движение своего собственного промотора и транскрибируется в виде отдельных цепей антитела перед сборкой в ​​эндоплазматический ретикулум. С другой стороны, мульти-cistronic векторы имеют внутренние рибосомы сайте вступления (IRES) элементы , включенные , которые делают возможной экспрессию множественных генов как одного транскрипта мРНК с переводом разрешенной из внутренних областей мРНК 11. В этом случае, тяжелые и легкие цепи гены, кодирующие соединены в Arrangement достичь коэкспрессии обоих цепей антитела 10, 12.

В то время как трансфицированы клетки дают достаточное количество белка, чтобы выполнить ограниченное число экспериментов, стабильно трансфецированные клеточные линии, которые претерпели выбор для интеграции генома может обеспечить более высокие урожаи. Более высокие количества белка позволяют для развития анализа , относящейся к характеристике в пробирке и может обеспечивать индикацию качества антител в рассмотрении для последующих применений , таких как клональной клеточной линии и свинцового отбора кандидатов.

Цель данной статьи состоит в том, чтобы описать стабильную экспрессию и очистку терапевтического антитела, продуцируемого в системе экспрессии млекопитающих. В самом деле, этот метод может быть применен к экспрессии биоподобие антитела. Метод может быть использован для начальной характеризации антител, прежде чем перейти к критическим, хотя и трудоемкого STEпс идентификации желаемого клона для увеличения производства масштаба. Более того, этот метод может быть использован, чтобы выразить другие белки, а не только антитела.

Следующее подробное протокол описывает экспрессию терапевтического антитело трастузумаб. Она состоит из подготовки векторной ДНК с последующей стабильной трансфекции в клеточной линии и очистки белка антитела НЕК-293 с помощью автоматизированного метода хроматографического.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Подходящий экспрессирующий вектор млекопитающих необходимо использовать для этого протокола. Здесь одна конструкция , содержащая две кассеты экспрессии используется (т.е. тяжелой и легкой цепи выражение приводится в движение отдельными промоутеров). Трастузумаб тяжелые и легкие цепи были ранее клонировали в вектор. Этот вектор был подарок от Andrew Beavil, полученные через не некоммерческий плазмиды хранилище 13.

1. Восстановление и Расширение масштабов векторной ДНК

Примечание: Вектор ДНК была получена в качестве мягкого агаре колотой в кишечной палочки XL-1 синий штамм; вектор несет резистентность к гигромицину.

  1. Вставьте стерильный прививка укол или петлю в мягком агаре из колотой культуры, то полоса Лурия Бертани (LB) агар пластины, приготовленной с 75 мкг / мл гигромицину для изолированных колоний. Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение 18-24 ч.
  2. Привить одну колонию в 5 мл бульона Потрясающе (ТБ), содержащей 75 мкг / мл гигромицин. INCUBATE культуры при 37 ° С в течение 18-24 ч при 225 оборотов в минуту встряхивая.
  3. С помощью Ночную культуру, чтобы подготовить глицерине векторной ДНК путем осторожного перемешивания 800 мкл культуры с 200 мкл 80% глицерина в криопробирку и замораживают при температуре -80 ° С.
    1. Добавьте 100 мкл ночной культуры до 100 мл , содержащей 75 ТБ мкг / мл гигромицину в разделительными перегородками шейкер колбу (т.е. 1/1000 разведение). Инкубируйте культуру при 37 ° С в течение 18-24 ч при 225 оборотов в минуту встряхивая.
  4. После культивирования в течение ночи, извлечения и очистки ДНК в соответствии с инструкциями производителя миди / макси подготовки комплекта со следующим исключением; во время финальной стадии, элюирования или Ресуспендируют ДНК с водой (рН 7,0-8,5).
  5. Проверка концентрации и чистоты ДНК с помощью значений оптической плотности при 260 и 280 нм, а затем хранить ДНК при -20 ° С.
    Примечание: Необязательно (настоятельно рекомендуется): Последовательность ДНК с использованием векторной специфических праймеров для подтверждения личности.

2, Стабильное Трансфекция НЕК-293 клеток

  1. Grow и поддерживать НЕК-293 клеток (клеток суспензии) в соответствии со стандартными протоколами в бессывороточной среде с добавлением 0,1% неионогенного поверхностно-активного вещества в колбах Эрленмейера. Поддерживать в 2 × 10 5 клеток / мл и субкультуры каждый четвертый день. Культуры клеток при 37 ° С с 5% СО 2 и вращения 120 оборотов в минуту.
    Примечание: Клетки должны быть в культуре в течение не менее 4 дней и не более чем за 4 недели до трансфекции. НЕК-293 клеток, выращенных в виде монослоев в содержащей сыворотку средах также могут быть использованы для этой процедуры.
  2. В день до трансфекции, семена НЕК-293 , в 3 × 10 5 клеток / мл в лунки 12-луночного планшета в 2 мл Дульбекко Modified Eagle медиа (DMEM) с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки ( ФБС). В день трансфекции, убедитесь, что клетки достигли 80-90% слитности
  3. Развести ДНК и полиэтиленимина (PEI) отдельно в средствах массовой трансфекции затем смешать вместе.
    1. Развести 1,25 мкг векторной ДНК на лунку (15 мкг на 12 лунок) в 300 мкл трансфекции средах. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
    2. Развести 2,5 мкл 1 мг раствора / мл PEI (30 мкл на 12 лунок, то есть соотношение 1: 2 ДНК к PEI) в 300 мкл трансфекционного сред. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
    3. Добавить разбавленный ДНК в разбавленном PEI, осторожно перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин.
  4. Добавляют 50 мкл смеси по каплям ДНК / PEI в каждую лунку планшета. Rock пластину осторожно , чтобы распределить трансфекцию смесь затем поместить планшет при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в течение 24 часов.
  5. Добавить 50 мкг / мл гигромицину B на лунку и вернуть пластину до 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в течение 10 дней.
    Примечание: В 10-й день, ООН-трансфецированные клетки погибли и отделяться от поверхности пластины, в то время как стабильно трансфицированные клетки будут жизнеспособны и прикреплены к пластине.
  6. Заменить СМИ в скважинах с1/4 объема сыворотки среды и 3/4 объема DMEM с добавлением 10% FBS (т.е. 0,5 мл сыворотки среды + 1,5 мл DMEM = 7,5% конечной концентрации в сыворотке крови) и инкубировать в течение 4 -х дней.
  7. Заменить носитель в скважинах с 1/2 объема не содержащей сыворотки среды и 1/2 объема DMEM , дополненной 10% FBS (т.е. 1 мл не содержащей сыворотки среды + 1 мл DMEM , = 5% конечная концентрация сыворотки) и инкубируют в течение 4 -х дней.
  8. Заменить СМИ в скважинах с 3/4 объема сыворотки среды и 1/4 объема DMEM с добавлением 10% FBS (т.е. 1,5 мл сыворотки среды + 0,5 мл DMEM = 2,5% конечной концентрации в сыворотке крови) и инкубировать в течение 4 -х дней.
  9. Заменить носитель в скважинах с 2 мл не содержащей сыворотки среды, дополненной 0,1% неионогенных поверхностно-активных веществ (т.е. 0% конечной концентрации в сыворотке крови) и инкубируют в течение 4-х дней.
    Примечание: Поддержание 50 мкг / мл гигромицина селективное давление на клетки, во время адаптации без сыворотки. Клетки, адаптированные к бессывороточной среде отрываются от поверхности скважин и может Группа Iп подвеска. Обратитесь к шагу 2.1 для условий культивирования с дополнительной добавки 50 мкг / мл гигромицина B.
  10. С помощью пипетки, аккуратно перемешать суспензионных культур в планшете и бассейн ячеек 12-луночных в отдельную пробирку.
    1. С помощью гемоцитометра, перечислить объединенные клетки и семена в 30 мл не содержащей сыворотки среды в колбе Эрленмейера на 2 - х 10 5 клеток / мл. Культуры клеток при 37 ° С с 5% СО 2 и вращения 120 оборотов в минуту. Субкультура и расширить каждый четвертый день.
  11. Продолжать расширять размер культуры до требуемой плотности клеток , чтобы получить 10 ампул в количестве 1 х 10 7 клеток / флакон для криоконсервации в жидком азоте. Замораживание клеток в бессывороточной среде, содержащей 10% диметилсульфоксид (ДМСО).
    Примечание: Кондиционированные среды, содержащие антитела, могут быть собраны в каждой субкультуры, чтобы подтвердить производство белка или использованы для оптимизации условий очистки. Для сбора кондиционированной среды и поддержания клеток для субкультуры, центрифугировать культуру в300 мкг в течение 5 мин, затем фильтруют стерилизовать супернатанта через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Отфильтрованный супернатант может храниться при температуре 4 ° С в течение 1-2 недель или при -20 ° С в течение более длительного срока хранения.

3. Антитело Производство Крупномасштабное от партии зарастают культуры

Примечание: Получение антител можно проследить на этапе из 2.11, где существующие клетки разлагаются до требуемой плотности клеток на основе пакетного зарастают объема культуры, чтобы быть установлен. В противном случае, клетки, которые были размороженные из криоконсервации начинают на этом этапе Вспененные до соответствующей плотности клеток и объема. Различные добавки культура может быть использована для оптимизации производства антител; использование триптона увеличить выход антител демонстрируется в этом протоколе.

  1. Семенной клеток в 2 х 10 5 клеток / мл в 100 мл не содержащей сыворотки среды в двух колбах Эрленмейера (для сравнения урожайности антитела из без карнозина и питательными веществами , дополненной культур). Культура при 37 ° С, 5% СО 2 и 120 оборотов в минуту.
  2. Через 24 часа добавляют триптона до конечной концентрации от 0,5% до питательными веществами, дополненной культуры. Уравнивание объем ун-добавляемой культуры с бессывороточной СМИ.
  3. С 8-й день, выполняют кровяных клеток из культур ежедневно с использованием гемоцитометра для мониторинга жизнеспособности клеток. Урожай супернатантов культуры, как только жизнеспособность клеток меньше, чем 80%.
    1. Урожай супернатант центрифугированием культур при 3000 х г в течение 15 мин, затем фильтруют стерилизовать супернатант (содержащий антитела), через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Храните супернатантов при 4 ° С (кратковременно) или заморозить при -20 ° C (в долгосрочной перспективе).

4. Антитело После очистки с помощью аффинной хроматографии с использованием автоматизированной быстрой жидкостной хроматографии протеинов (FPLC) Система

Примечание: Следующая процедура в общем случае может быть применен к наиболее автоматизированных систем. Очистка может быть проведена при комнатной температуре или при температуре 4 ° С (если система FPLC хранится в прохладном помещении).Серия скаутских испытаний могут быть выполнены, чтобы определить оптимальные условия очистки, включая соответствующую матрицу-столбец, связывающего буфера, буфера для элюции и рН, чтобы обеспечить максимальное извлечение очищенного антитела из кондиционированной среды (см Результаты разделе). Оптимальные условия зависят от антитела или белок очищается. Очисток были выполнены на автоматизированной системе FPLC. Очисток были выполнены при комнатной температуре с помощью 5 мл белка колонну.

  1. Подготовьте следующие буферы с использованием сверхчистой воды и отрегулировать до рекомендованного рН затем фильтруют через фильтр 0,22 мкм.
    1. Готовят 1 л фосфатного буферного солевого раствора (PBS) , рН 7,4 (буфер) связывание путем смешивания следующих: 0,14 М NaCl, 0,0027 М КСl, 0,01 М Na 2 HPO 4 и 0,001 М KH 2 PO 4. Отрегулируйте рН, если это необходимо перед фильтрацией буфера.
    2. Приготовьте 500 мл 0,1 М глицин-HCl рН 2,7 (буфер для элюции). Отрегулируйте рН до фильтрации баффэ.
    3. Приготовьте 50 мл 1 М Трис, рН 9,0 (буфер нейтрализации).
  2. Убедитесь, что все электрические и коммуникационные соединения системы с компьютером сделаны. Устройства должны быть видны в программном обеспечении модуля 'Control System'. Обеспечить ультрафиолетовый датчик установлен на 280 нм, длина волны. Дополнительно: Калибровка рН-метр, если он подключен и будет использоваться.
  3. Погрузитесь впускные трубы A, B и насос для отбора проб в сверхчистой воды для промывки системы. Чистки наработку с помощью шприца при наличии воздуха в трубопроводе или подозрение воздуха в системе. Промыть систему водой с помощью ручного управления с помощью системного контроллера или с помощью автоматизированного метода. Заметим, что давление, проводимость, UV280 трассировка и рН остаются неизменными и что предельное значение давления для столбца не превышается в соответствии со спецификацией производителя.
    Примечание: Аномалии может указывать на воздух или закупорки в системе, которые должны быть решены, прежде чем продолжить.
  4. В модуле системного контроллера, запустите скорость потока на 1мл / мин вручную с помощью насоса А в любой нагрузки (в обход цикла выборки) или инъекции (через петлю образца) положение, чтобы начать подключение колонки. Отключение системы трубопроводов на входе в положение колонки и удалите фиксатор, соединенный с впускным отверстием колонны.
    1. Дайте воде вытекать из каплям системы насосно-компрессорных труб в верхней части колонны, а затем прикрепить трубку к системной колонки. Имея входное отверстие колонки и входной патрубок перелива с каплями воды обеспечивает соединение без пузырьков воздуха.
  5. Прикрепите выход колонки на выходной розетке и проверьте все соединения плотно закреплены. С колонкой, присоединенное к системе, не превышают пределы для максимального предела давления и расхода, как указано в спецификации столбца.
  6. Промыть колонку с 5 объемами колонки (CV) воды. При необходимости, продолжайте мыть колонки, пока трассировка UV280 не стабилизируется.
  7. Погрузитесь впускных трубок в связывающем буфере, B в элюирующего буфера и насос для отбора проб в связывающем буфере тO уравновесить систему в правильных буферами. Заполните впускной трубы с использованием буфера PumpWash в ручном режиме.
  8. В модуле "Редактор метода" программного обеспечения, с помощью мастера настройки метода для метода аффинной хроматографии на колонке, который предназначен для использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Автоматизированные FPLC системы поставляются с методами предварительно заполненных с рекомендованными настройками (т.е. скорость потока и предельное значение давления) и выполняются действия , основанные на колонке (производитель, матрицы и размер) , выбранной для очистки.
    1. Используйте следующие шаги выполнения для протеина А для аффинной хроматографии:
      1. Равновесие системы с 5 CV буфера для связывания и сбора flowthrough в контейнер для отходов.
      2. Образец Нагрузка на колонку (объем должен быть загружен задается вручную в методе) и собирают flowthrough в отдельный контейнер.
      3. Система Wash с 5 CV буфера для связывания и сбора flowthrough в отдельный контейнер.
      4. колонка Элюировать с 5 CV isocratIC фракционирования с использованием буфера для элюции и собирают очищенный образец антител в качестве фракций с помощью коллектора фракций.
      5. Равновесие системы с 5 CV буфера для связывания и сбора flowthrough в контейнер для отходов.
  9. После того, как метод был установки, указать объем кондиционированной среды, которые будут применены к колонке и сохраните метод.
    Примечание: Указанный объем в методе должен быть на 5-10 мл меньше, чем фактический объем, чтобы избежать попадание воздуха во время выборки прогона. Указанный объем используется в данном протоколе является 90-120 мл.
  10. Погрузить образец насоса трубки в емкость, содержащую кондиционированной среды.
  11. Подготовьте отдельный контейнер для сбора образца flowthrough через указанный выпускной трубы.
    Примечание: Важно, чтобы собрать flowthrough в случае возникновения ошибки во время бега или связывающей способности колонны превышено требующих flowthrough быть повторно в колонну или очистки гepeated.
  12. Приготовьте сбор труб в коллектор фракций. Добавляют 100 мкл нейтрализующего буфера на 1 мл объема фракции. Система FPLC автоматически элюции фракции в приборке.
  13. В модуле "Control System 'программного обеспечения, откройте метод для запуска.
    Примечание: Метод запуска инициируется в серии страниц, которые включают проверку переменных метода, фракции установки коллектора и определение имени файла результата и место хранения.
  14. Нажмите START, чтобы начать бег. Прогон можно контролировать в модуле «контроля системы».
  15. По завершении прогона очистки, проверить полученную хроматограмму в модуле «Оценка» в системном программном обеспечении.
  16. Смешайте все белковые фракции, содержащие в отдельную пробирку, обмена буфера и концентрируют в PBS с использованием центробежного устройства фильтра с 30 кДа молекулярной массой отрезан. Выполните шаги центрифугирования в соответствии с производителеминструкции.
  17. Измерение концентрации антител с помощью анализа бицинхониновой кислоты (BCA) в соответствии с инструкциями изготовителя.
  18. Если другой очистки перспективе должна быть выполнена, премьер трубки образца насоса в связывающем буфере и повторите шаги 4.9-4.14.
  19. По завершении очистки трасс, погрузить впускные трубы A, B и насос для отбора проб в сверхчистой воде и промыть систему и колонку, как выполняется на шаге 3.
  20. Погрузитесь A, B и насос для отбора проб трубки в 20% этанола и повторить процедуру промывки для хранения системы и колонки.
  21. Отсоедините колонку от нижнего выпускного отверстия и заменить колонки пробку, затем отключить колонку на входе и заменить пробку, подсоедините шланг к системе. Хранить колонку при температуре 4 ° С.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Стабильное производство трастузумаб путем трансфекции клеток НЕК-293 , была подтверждена с использованием био-слойный интерферометрии (BLI) , как представлено на рисунке 1. Стандартной кривой IgG был сгенерирован путем измерения связывания скорости между стандартом антител IgG и белок А биосенсора (рис 1А). Образец сырой супернатант аналогичным образом измерено, а затем его концентрация интерполированное из стандартной кривой (рис 1б). К...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол подробно трансфекцией стабильной экспрессии и очистки терапевтического антитела в клетках НЕК-293. Стабильная экспрессия генов антител является первым шагом в генерации антител, производящих клеточную линию для разработки и производства терапевтического антитела. В то время как клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки остаются выражение платформой для терапевтических белков, клеточную линию НЕК-293 приобретает известность с осознанием того, что белки, продуцируемые в этих клеток более точное соответ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Исследование было поддержано Университетом Сиднея. pVITRO1-Трастузумаб-IgG1/κ был подарком от Эндрю Бивила (плазмида Addgene # 61883). Благодарим Тихомира Сергеевича Додева за полезные дискуссии по поводу pVITRO1-Трастузумаба-IgG1/κ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Векторы серии pFUSEInvivoGenN/AТяжелые и легкие антитела экспрессируются в отдельных векторах, требующих котрансфекции.
Векторная серия mAbXpressACYTE Biotech Pty Ltd.Гены тяжелых и легких антител экспрессируются в отдельных векторах, требующих котрансфекции. См.: Jones, M. L. et al. Метод быстрого, независимого от лигирования переформатирования рекомбинантных моноклональных антител. J Иммунологические методы. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
pVITRO1 векторN/AN/AГены тяжелых и легких антител управляются отдельным промотором в одном векторе. См.: Dodev, T. S. et al. Набор инструментов для быстрого клонирования и экспрессии рекомбинантных антител. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
Вектор серии GSLonzaMulti-cistronic vector с тяжелыми и легкими генами антител, коэкспрессируемыми и транслируемыми в виде одиночного транскрипта.
Multi-cistronic vector series 1N/AN/AMulti-cistronic вектор с тяжелыми и легкими генами антител, коэкспрессируемыми и транслируемыми в виде одиночного транскрипта. См.: Li, J. et al. Сравнительное исследование различных векторных дизайнов экспрессии рекомбинантных антител IgG у млекопитающих. J Иммунологические методы. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Multi-cistronic vector series 2N/AN/AMulti-cistronic вектор с тяжелыми и легкими генами антител, коэкспрессируемыми и транслируемыми в виде одиночного транскрипта. См.: Ho, S. C. et al. IRES-опосредованные трицизтронные векторы для усиления генерации высокомоноклональных антител, экспрессирующих клеточные линии CHO. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-трастузумаб-IgG1/κAddgene61883Экспрессионный вектор млекопитающих, содержащий гены антител к трастузумабу с геном резистентности к гигромицину; pVITRO1-Трастузумаб-IgG1/κ был подарком Эндрю Бивила.
Fast-Media Hygro AgarJomar Life Researchfas-hg-sИспользуется для приготовления агара с низким содержанием соли LB, содержащего 75 &; г/мл гигромицина.
Fast-media Hygro TBJomar Life Researchfas-hg-lИспользуется для приготовления бульона с низким содержанием соли для туберкулеза, содержащего 75 &; г/мл гигромицина.
Глицерин, BioXtra и ге; 99%Sigma-AldrichG6279Подготовьте до 80% водой и автоклавом. Хранить при комнатной температуре.
Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi KitAstral ScientificG221020Plasmid Maxi Prep Kit; элюировать или ресуспендировать ДНК в воде (pH 7,0-8,5).
Клеточная линия FreeStyle 293-F CellsLife TechnologiesR790-07HEK-293, адаптированная к суспензионному культивированию в бессывороточных средах.
FreeStyle 293 Expression MediumLife Technologies12338-018Бессывороточная среда, специально разработанная для поддержания клеточной линии 293-F и высокой экспрессии белка.
Kolliphor P188Sigma-AldrichK4894Неионогенное поверхностно-активное вещество; плуроновое F-68; готовить до 10% в воде и фильтровать-стерилизовать с использованием 0,22 μ м. Хранить при температуре 4 °C.
ДМЭМ, с высоким содержанием глюкозы;Life Technologies11995-065
Термоинактивированная сыворотка плода крупного рогатого скотаLife Technologies10082-147
Полиэтиленимин, линейный, MW 25,000 Polysciences, Inc.23966Приготовьте до 1 мг/мл в воде. Отрегулируйте до pH 7,0 с помощью 1 М HCl (раствор становится прозрачным) и профильтруйте-стерилизуйте с помощью 0,22 мкм; м. Хранить при -80 °deg; C до использования.
OptiPro SFMLife Technologies12309-050Трансфекционная формула бессывороточная среда
Раствор гигромицина B JomarLife Researchant-hg-1
Диметилсульфоксид (ДМСО)Thermo Fisher ScientificAJA2225
триптон (пептон казеина)Thermo Fisher ScientificLP0042BПриготовьте до 20% в PBS и отфильтруйте-стерилизуйте с использованием 0,22 мкм; м. Хранить по адресу 4 
Фосфатно-солевой буфер (PBS) таблетки, pH 7,4, 100 млAstral Scientific09-2051-100
HiTrap Protein A High Performance, 1 колонка по 5 млSigma-AldrichGE17-0403-01
AKTAочиститель 100GE Healthcare28406266Автоматизированная система FPLC, которая может включать насос для отбора проб P-960 и сборник фракций Frac-920.
Глицин-HClSigma-AldrichG2879
Лимонная кислота, моногидратAstral ScientificBIOC2123
цитрат натрия, дигидрат тринатриевой соли Astral ScientificBIOCB0035
1 М раствор Tris-HCl pH 9,0Astral ScientificBIOSD8146
Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO)Merck MilliporeUFC803008/UFC903008Используется для буферного обмена и концентрации очищенного белка.
Набор для анализа бицинхониновой кислоты (БЦА)Пирса Thermo Fisher Scientific23227
BLItz Systemforté BIO45-5000Прибор для измерений биослойной интерферометрии (BLI).
Биосенсоры белка Афорта; BIO18-5010
Акриламид/Бисаакриламид (37,5:1), 40% растворAstral Scientific786-502
Персульфат аммония (APS)Astral ScientificAM0486
TEMEDAstral ScientificAM0761
Coomassie Brilliant Blue R-250Astral Scientific786-498
Precision Plus Dual-Color Protein Стандартный1610374Bio-Rad

Ссылки

  1. Nelson, A. L., Reichert, J. M. Development trends for therapeutic antibody fragments. Nat Biotechnol. 27 (4), 331-337 (2009).
  2. Drake, P. M., Rabuka, D. An emerging playbook for antibody-drug conjugates: lessons from the laboratory and clinic suggest a strategy for improving efficacy and safety. Curr Opin Chem Biol. 28, 174-180 (2015).
  3. Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Bispecific antibodies. Drug Discov Today. 20 (7), 838-847 (2015).
  4. Beck, A., Wurch, T., Bailly, C., Corvaia, N. Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies. Nat Rev Immunol. 10 (5), 345-352 (2010).
  5. Food and Drug Administration. 22, Food and Drug Administration. eds U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), & Center for Biologics Evaluation and Research (CBER) (2015).
  6. European Medicines Agency. 13, European Medicines Agency. eds European Medicines Agency (EMA) & Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) (2014).
  7. Lopez-Morales, C. A., et al. Physicochemical and biological characterization of a biosimilar trastuzumab. Biomed Res Int. 2015, 427235(2015).
  8. Jung, S. K., et al. Physicochemical characterization of Remsima. MAbs. 6 (5), 1163-1177 (2014).
  9. Visser, J., et al. Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab. BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).
  10. Li, J., et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124 (2007).
  11. Fitzgerald, K. D., Semler, B. L. Bridging IRES elements in mRNAs to the eukaryotic translation apparatus. Biochim Biophys Acta. 1789 (9-10), 518-528 (2009).
  12. Ho, S. C., et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139 (2012).
  13. Dodev, T. S., et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4, 5885(2014).
  14. Walsh, G. Post-translational modifications of protein biopharmaceuticals. Drug Discov Today. 15 (17-18), 773-780 (2010).
  15. Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), 96(2008).
  16. Bebbington, C. R., et al. High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker. Biotechnology (N Y). 10 (2), 169-175 (1992).
  17. Kaufman, R. J., et al. Coamplification and coexpression of human tissue-type plasminogen activator and murine dihydrofolate reductase sequences in Chinese hamster ovary cells. Mol Cell Biol. 5 (7), 1750-1759 (1985).
  18. Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
  19. Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 90 (3), 332-344 (2005).
  20. Pham, P. L., et al. Large-scale transient transfection of serum-free suspension-growing HEK293 EBNA1 cells: peptone additives improve cell growth and transfection efficiency. Biotechnol Bioeng. 84 (3), 332-342 (2003).
  21. Yang, W. C., et al. Addition of valproic acid to CHO cell fed-batch cultures improves monoclonal antibody titers. Molecular Biotechnology. 56 (5), 421-428 (2014).
  22. Backliwal, G., et al. Valproic acid: a viable alternative to sodium butyrate for enhancing protein expression in mammalian cell cultures. Biotechnol Bioeng. 101 (1), 182-189 (2008).
  23. Jiang, Z., Sharfstein, S. T. Sodium butyrate stimulates monoclonal antibody over-expression in CHO cells by improving gene accessibility. Biotechnol Bioeng. 100 (1), 189-194 (2008).
  24. Jordan, M., Wurm, F. Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate. Methods. 33 (2), 136-143 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Производство терапевтических антителклеточная линия HEK-293стабильная трансфекциятрансфекция полиэтилениминомадаптация к бессывороточной средеаффинная хроматографияочистка методом FPLCизмерение выхода антителзамена буфераинтерферометрия биослоев
Лабораторные весы Получение и очистка терапевтического антитела
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.