Analyse optimisée des<em&gt; In Vivo</em&gt; et<em&gt; In vitro</em&gt; Stéatose hépatique

Résumé

Ici, des méthodes optimisées pour générer des modèles in vivo et in vitro de stéatose hépatique et pour analyser les phénotypes stéatotiques et les paramètres physiologiques associés sont décrites.

Résumé

L’établissement d’un système de procédures pour caractériser qualitativement et quantitativement la stéatose hépatique in vivo et in vitro est important pour l’étude métabolique dans le foie. Ici, de nombreux tests sont décrits pour mesurer de manière exhaustive le phénotype et les paramètres de la stéatose hépatique dans des modèles murins et hépatocytaires.

Combinant les méthodes physiologiques, histologiques et biochimiques, ce système peut être utilisé pour évaluer la progression de la stéatose hépatique. In vivo, les mesures du poids corporel et de la résonance magnétique nucléaire (RMN) permettent une compréhension générale des souris de manière non invasive. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) et au rouge d’huile O détermine la morphologie histologique et le dépôt lipidique du tissu hépatique dans des conditions de surcharge en nutriments, telles que l’alimentation riche en graisses. Ensuite, le contenu total en lipides est isolé par extraction au chloroforme/méthanol, qui est suivie d’une analyse biochimique des triglycérides et du cholestérol. De plus, les hépatocytes primaires de souris sont traités avec un taux élevé de glucose et d’insuline pour stimuler l’accumulation de lipides, un modèle in vitro efficace pour imiter l’hyperglycémie induite par l’alimentation et l’hyperinsulinémie in vivo. Ensuite, le dépôt lipidique est mesuré par coloration au rouge d’huile O et extraction au chloroforme/méthanol. La coloration Oil Red O détermine les phénotypes stéatotiques hépatiques intuitifs, tandis que l’analyse d’extraction des lipides détermine les paramètres qui peuvent être analysés statistiquement. Les protocoles actuels intéressent les scientifiques dans les domaines de la stéatose hépatique, de la résistance à l’insuline et du diabète de type 2.

Introduction

L'obésité est un problème de santé en plein essor dans les pays développés et en développement. Il a été rapporté comme étant l' une des conditions coexistant fréquemment associés à la stéatose non alcoolique du foie (stéatose hépatique non alcoolique), avec une prévalence variant entre 30 et 100 pour cent chez les patients NAFLD ^1. En raison de la forte corrélation entre le foie gras et l' obésité, (DIO) modèles induits par l' alimentation de souris obèses sont largement utilisés pour étudier les mécanismes moléculaires complexes associés au développement de NAFLD ^{2, 3, 4, 5, 6.} La stéatose hépatique est la première étape de NAFLD, et il peut évoluer vers la stéatohépatite non alcoolique (NASH), la cirrhose, et finalement, un cancer du foie ^7. Par conséquent, l'objectif global de cette méthode est de générer des modèles animaux et cellulaires des conditions stéatosiques hépatiques et de provide protocoles détaillés pour la mesure des lipides efficace et précis. Ces modèles et mesures sont également utiles pour l'étude d'autres troubles métaboliques, tels que la résistance à l'insuline et le diabète de type 2.

Comme l'obésité est identifiée comme l'un des principaux facteurs de risque pour la SHNA, une haute teneur en matières grasses, de haute-sucrose alimentation (HFHS) qui imite le style occidental régime riche en graisses est utilisé pour induire l'obésité chez les souris. Par la suite, le degré de stéatose hépatique peut être évaluée à l'aide de différentes méthodes. Tout d'abord, le poids corporel et de l'analyse de la composition corporelle avec la résonance magnétique nucléaire (RMN) montrent l'accumulation de lipides pendant l'heure du repas. La masse grasse et la masse maigre peuvent être quantifiés de façon non invasive et en temps réel.

En outre, l'imagerie par résonance magnétique (IRM) est utilisée pour montrer à la fois l'ensemble du corps et de la répartition du foie de la graisse. Le signal de niveau de gris de l'analyse de l'IRM peut être convertie en une image lisible en pseudo-couleurs, et l'intensité dele niveau de gris et la couleur est hémi-quantifiable. Cette technologie offre des avantages uniques pour la mesure de l'accumulation des lipides dans les animaux vivants. Deuxièmement, l'analyse histologique du foie est la méthode la plus couramment utilisée pour déterminer la stéatose hépatique. Hématoxyline et à l'éosine (H & E) fournit des informations de coloration histologique, comme une morphologie hépatocytaire et l'infiltration des macrophages, tandis que l'huile rouge O coloration indique la taille et la position des gouttelettes lipidiques dans les hépatocytes. En troisième lieu, l'analyse de la teneur en lipides par extraction au chloroforme / méthanol est une mesure précise et quantitative des lipides hépatiques. Total des taux de triglycérides et de cholestérol peuvent être mesurés avec des méthodes biochimiques. Fait important, l'analyse de l'extraction des lipides et à l'huile rouge O coloration peuvent également être utilisés dans génétiquement manipulées ou traitées pharmaceutiquement hépatocytes.

L'avantage du présent procédé est son utilisation d'approches multiples optimisées pour générer des modèles de stéatose hépatiqueet de caractériser complètement les phénotypes in vivo et in vitro. Les modèles DIO de souris peuvent récapituler les pathologies métaboliques et phénotypes de la maladie du foie gras humain. D' autres paramètres métaboliques chez l' homme peuvent être reproduits dans ce modèle ainsi ^8. La génération du modèle d'hépatocytes stéatosique en réponse à glucose élevé, plus l'insuline est efficace, utile, et surmonte la limitation des travaux coûteux et fastidieux souris. Pris ensemble, ces méthodes sont suffisantes et indispensables pour l'étude de la dysfonction hépatique des lipides et de la résistance à l'insuline lors de la surcharge des éléments nutritifs.

Protocole

Tous les animaux protocoles expérimentaux ont été approuvés par le soin des animaux et l'utilisation comité institutionnel à l'Institut des sciences de la nutrition, les instituts de Shanghai des sciences biologiques, Académie chinoise des sciences (Shanghai, Chine).

1. DIO Modèle de souris

1. HFHS alimentation
   1. Nourrir les huit semaines vieux mâle C57BL / 6 avec un HFHS qui contient 40 kcal% de matières grasses et 40 kcal% de saccharose. Maison eux dans 12 h conditions de cycle sombre lumière.
   2. Garder la souris en HFHS état alimentation-alimentation pour quatre à seize semaines. Vérifiez l'hebdomadaire de poids corporel.
2. Body analyse de la composition et de pseudo-couleur analyse d'image
   1. Soumettre les souris à une analyse de composition corporelle de l'analyseur.
      1. Fixer des souris conscientes, non anesthésié dans un tube en plastique dans le. Mesurer la masse de graisse corporelle, la masse maigre, et les fluides en utilisant un système RMN, comme décrit précédemment ^2.
   2. Balayer tout le corps de chaque souris en utilisant un système d'IRM.
      1. Anesthésier les souris avec 1% d'Avertin par injection intrapéritonéale (25 ul / g) et d'effectuer l'analyse d'imagerie dans des tubes en verre spécialisés.
         NOTE: Le processus d'imagerie dure près de 0,5 h pour chaque souris. Lorsque la mesure est terminée, retourner les souris dans leur cage.
   3. Numériser l'ensemble des corps des souris en dorsale, au milieu, et les couches ventrales; balayer le foie dans la direction verticale. Utiliser un aimant 0,55 T et les paramètres instrumentaux suivants: K espace = 192 x 256 um, l'épaisseur de la section = 3 mm, TE = 14,8 ms, TR = 400 ms, FOVRead = 100 mm, FOVPhase = 100 mm, nombre de balayages = 8. balayage en utilisant le même état magnétique pour les tous les groupes de souris.
   4. Carte de l'image en niveaux de gris sur une image pseudo-couleur en fonction de l'intensité du signal ^9.
3. l' euthanasie Souris
   1. Stériliser dissectioutils ng, tels que pinces et ciseaux.
   2. Verser isoflurane suffisante sur une serviette en papier et laissez l'isoflurane volatiliser dans un bocal en verre. Assurez-vous que les souris sont euthanasiées par l'isoflurane.
   3. Fixer les souris sur une table d'opération. Vaporiser chaque abdomen avec 75% d'éthanol, faire une incision dans le derme du processus xiphoïde avec des ciseaux, et déchirer le derme longueur à travers la ligne médiane avec les mains pour exposer le péritoine.
   4. Serrer l'appendice xiphoïde avec une pince et couper le sens de la largeur du péritoine à travers le fond des nervures pour exposer les viscères.
   5. Recueillir le sang dans des tubes EDTA revêtu par ponction cardiaque.
   6. Couper le diaphragme le long du foie et retirer délicatement le foie des enterocoelia en utilisant des ciseaux fins. Couper trois morceaux de tissu du foie pour les mesures de lipides suivantes: a) 6 x 3 x 3 mm pour une coloration H & E, b) 6 x 3 x 3 mm pour l'Oil Red O coloration, et c) de 20 à 40 mg de foie chloroforme / l'extraction du méthanol.
4. Coloration H & E
   1. Fixer le foie dans 4% tamponné au phosphate acétate de formaline à 4 ° C pendant une nuit, puis l'incorporer dans de la cire de paraffine.
   2. Couper des sections de paraffine (5 um) et les monter sur des lames de verre pour coloration H & E, comme décrit précédemment ^{3, 10.}
5. Oil Red O coloration
   1. préparation Regent
      1. Préparer la solution de travail Oil Red O avec 10% de formaline, 60% d'isopropanol, l'hématoxyline, et le glycérol gelée. Dissoudre 0,5 g d'huile rouge O poudre avec 100 ml d'isopropanol et chauffer dans un bain de 60 ° pour obtenir une solution stock à 0,5%.
      2. Diluer avec de l' eau distillée deux fois (ddH ₂ O) dans un rapport de 3: 2 (3 ml de solution mère et 2 ml de ddH ₂ O). Filtrer la solution de travail et laisser reposer pendant au moins 10 min à température ambiante.
   2. Incluez le foie de la température de coupe optimale (OCT) composé dans apboîte d'encastrement lastic. Congeler à -20 ° C pendant 30 min. Coupez-les en sections de 8 pm dans un microtome de congélation, monter le tissu sur une lame, et placez-le à température ambiante pendant 30 min.
   3. Placez une serviette en papier dans le fond d'une cuve de coloration et verser une petite quantité de formol à 10% pour mouiller la serviette en papier. Placer la lame dans le bain de coloration et de fixer les coupes congelées dans des vapeurs de formaldéhyde pendant 5 min à 4 ° C.
   4. Plonger la lame dans 60% d'isopropanol dans le bain de coloration pendant 3 s; répéter une fois.
   5. Ajouter quelques gouttes de solution de travail Oil Red O à la diapositive pour couvrir tous les tissus et incuber pendant 15 min. Protéger le tissu de la lumière à température ambiante.
   6. Rincer la lame dans une nouvelle isopropanol à 60% dans le bain de coloration pendant 3 s; répéter deux fois.
   7. Rincer délicatement la lame à travers l'eau distillée deux fois et éliminer l'eau autour du tissu. Assurez-vous de ne pas sécher le tissu.
   8. Placez la lame dans hématoxyline pendant 1 min et rincer doucement à l'eau du robinet pendant 5-10min. Rincer délicatement la lame dans l'eau distillée deux fois et garder le dans de l'eau distillée jusqu'à ce que prêt à mettre sur la lamelle.
   9. Chauffer la gelée de glycérol dans le micro-ondes et de placer plusieurs gouttes sur le dessus du tissu. Placez délicatement la lamelle sur le dessus et de prendre soin de ne pas former des bulles.
   10. Observer la tache sous un microscope et capturer des images caractéristiques en utilisant 20X et 40X objectifs.
6. Mesure des lipides hépatiques
   1. Placer le tissu du foie disséqué dans un nouveau tube de centrifugation de 2 ml en matière plastique. Homogénéiser dans 1 ml de PBS avec un homogénéiseur et transférer le lysat dans un nouveau tube en verre de 15 ml.
   2. Ajouter 5 ml de chloroforme / méthanol (2: 1, v / v) solution, vortex vigoureusement le mélange pendant 1 min, et laisser reposer pendant 2 h sur la glace.
   3. Centrifugeuse à 1.650 xg pendant 10 min à 4 ° C; le mélange doit être séparée en 3 couches: la couche supérieure du méthanol, le disque de la protéine du milieu, et le chloroforme et les lipides de fond.
   4. Tran sfer la phase inférieure dans un nouveau tube de verre en utilisant un verre pipette Pasteur; il n'y a pas besoin d'obtenir chaque goutte de la fraction de queue. Réglez le tube de côté sur la glace.
   5. Ajouter 600 ul de 4 mM de _MgCl2 et 1,5 ml de chloroforme à la fraction de surnageant à gauche dans le tube précédent et vortexer vigoureusement. Incuber sur la glace pendant 30 min et centrifuger à 1.650 xg pendant 10 min à 4 ° C.
   6. Combiner la phase inférieure du premier tube de phase inférieure en utilisant une pipette Pasteur. Jeter les couches moyennes et supérieures.
   7. Evaporer le chloroforme sous azote gazeux dans un bain à 37 °. Laver les côtés des tubes en verre à fond avec 200 ul de 1% de Triton X-100 / chloroforme (v / v). S'évaporer sous azote gazeux. Dissoudre le lipide avec 200 ul de ddH ₂ O et vortex bien pour faire l'émulsion finale.
   8. Mesurer le triglycéride totale (TG) et le cholestérol (TC), les niveaux en utilisant un kit de triglycérides ou de cholestérol selon le protocole du fabricantxref "> 3.
      Remarque: Les valeurs lipidiques sont normalisées par rapport à celles des concentrations de protéines dans l'homogénat initial, tel que déterminé par la quantification des protéines ^3.

2. Primaire souris hépatocytes Modèle

1. Isolement des hépatocytes primaires de souris
   1. Anesthésier chaque souris avec 6% de l'hydrate de chloral (10 ul / g par voie intrapéritonéale).
   2. Isoler hépatocytes primaires, comme décrit précédemment ^10. Cultiver des cellules sur des lamelles de verre revêtues de collagène dans une plaque à 6 puits à une coloration rouge d'huile O. Pour l' extraction des lipides, ensemencer les cellules sur 10 cm boîte de culture cellulaire ^10.
2. Traitement cellulaire et Oil Red O coloration
   1. Remplacer le milieu avec 2 ml de milieu de famine et incuber à 37 ° C pendant 24 h. Traiter avec 30 mM de glucose et 100 nM d'insuline. Incuber dans un incubateur à 37 ° C, culture pendant 24 h.
   2. Aspirer le milieu. Ajouter 2 mL de PBS et agiter doucement pour rincer le milieu; répéter une fois.
   3. Fixer la lamelle à la lame avec une bande de caoutchouc. Exposer les cellules adhérentes à la surface extérieure. Effectuer la coloration Oil Red O comme décrit ci-dessus (étape 1.5).
      NOTE: Les niveaux de base de l'accumulation de lipides sont stimulés avec une glycémie élevée, plus le traitement de l'insuline après privation de sérum. Les gouttes de lipides sont visualisés par Oil Red O coloration.
3. Mesure des lipides
   1. Traiter les hépatocytes avec glucose élevé, plus l'insuline dans le même état (étape 2.2.1). Ajouter 1 ml de PBS à chaque boîte de culture cellulaire de 10 cm. Grattez les cellules et les récolter dans de nouveaux tubes de verre de 15 ml, à partir de laquelle des aliquotes de 100 ul sont transférés dans des tubes frais de 1,5 ml pour la quantification des protéines.
   2. Ajouter 4 ml de chloroforme / méthanol (2: 1, v / v) à 900 ul de cellules restantes. Soniquer pour approximativement 20 bips, puis vortexer vigoureusement pour libérerles lipides dans les cellules. Incuber le mélange sur de la glace pendant 2 h. Effectuer l'extraction des lipides (étape 1.6).

Résultats

Comme le montre la figure 1A, le poids du corps de la souris a été porté à 45 ± 1,2 g après 16 semaines de HFHS alimentation, qui est d' environ 1,5 fois plus élevée que dans le groupe régime alimentaire chow. La composition corporelle analyses RMN montrant la masse grasse et la masse maigre de souris sont indiqués (figure 1B). La distribution de graisse du corps tout entier et du foie ont été déterminées par IRM, et représentatives d' images en ...

Discussion

NAFLD est une série de maladies hépatiques progressives qui est associée au syndrome métabolique, l' obésité, la résistance à l'insuline, ou diabète de type 2 (DT2) ^11. La caractéristique de NAFLD est stéatose, l'accumulation de lipides dans les hépatocytes. Ici, un éventail de méthodes est présentée pour caractériser les phénotypes et les paramètres de la stéatose hépatique utilisant des souris DIO et les hépatocytes primaires de souris. Cette procédure pourrait être utile pour éluci...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
O.C.T COMPOUND	SAKURA	4583
Oil Red O	Sigma	O0625-25G
Infinity Triglycérides	kit Fisher  ; Scientific	TR22421
Infinity Cholesterol kit	Fisher  ; Scientific	TR13421
Collagène de type I, queue de rat	Millipore	08-115
DMEM (faible teneur en glucose)	Invitrogen	11885-092
Pénicilline / Streptomycine	Invitrogen	15140-122
FBS	Invitrogen	10099141
PBS	cellgro	R21-040-CVR
HBSS	cellgro	20-021-CV
Insuline	TOCRIS Bioscience	3435	dissoudre dans PBS, 1 mM pour stock
Glucose	Sigma	G8270-100G
Microscope	Olympus	BX53
Pompe péristaltique	Longerpump	BT100-2J
10 cm Plat de culture cellulaire	Corning	420167
6-well-plate	Corning	3516
BCA assay	Beyotime	P0010
Résonance magnétique nucléaire	Technologie Niumag	MiniQMR23-060H-I
Régime riche en graisses et en matières grasses (HFHS)	Régimes de recherche	D12327