Burada, hepatik steatozun in vivo ve in vitro modellerini oluşturmak ve steatotik fenotipleri ve ilgili fizyolojik parametreleri analiz etmek için optimize edilmiş yöntemler açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
İn vivo ve in vitro hepatik steatozu kalitatif ve kantitatif olarak karakterize etmek için bir prosedürler sistemi oluşturmak, karaciğerde metabolik çalışma için önemlidir. Burada, fare ve hepatosit modellerinde hepatik steatozun fenotipini ve parametrelerini kapsamlı bir şekilde ölçmek için çok sayıda test tanımlanmıştır.
Fizyolojik, histolojik ve biyokimyasal yöntemleri birleştiren bu sistem, hepatik steatozun ilerlemesini değerlendirmek için kullanılabilir. İn vivo, vücut ağırlığı ve nükleer manyetik rezonans (NMR) ölçümleri, farelerin non-invaziv bir şekilde genel bir şekilde anlaşılmasını sağlar. Hematoksilen ve Eozin (H & E) ve Yağ Kırmızısı O boyaması, yüksek yağlı diyet beslemesi gibi besin aşırı yüklenme koşulları altında karaciğer dokusunun histolojik morfolojisini ve lipid birikimini belirler. Daha sonra, toplam lipid içeriği kloroform/metanol ekstraksiyonu ile izole edilir, ardından trigliserit ve kolesterol için bir biyokimyasal analiz yapılır. Ayrıca, fare birincil hepatositleri, in vivo olarak diyete bağlı hiperglisemi ve hiperinsülinemiyi taklit etmek için etkili bir in vitro model olan lipid birikimini uyarmak için yüksek glikoz artı insülin ile tedavi edilir. Daha sonra, lipit birikimi, Yağ Kırmızısı O boyama ve kloroform / metanol ekstraksiyonu ile ölçülür. Yağ Kırmızısı O boyaması sezgisel hepatik steatotik fenotipleri belirlerken, lipid ekstraksiyon analizi istatistiksel olarak analiz edilebilecek parametreleri belirler. Mevcut protokoller, yağlı karaciğer hastalıkları, insülin direnci ve tip 2 diyabet alanlarındaki bilim adamlarının ilgisini çekmektedir.
Giriş
Obezite gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerde gelişen bir sağlık sorunudur. NAFLD hastalarda 1 yüzde 30 ila 100 arasında değişen bir prevalansı, sıklıkla alkol kaynaklı olmayan yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) ile ilişkili birlikte bulunan koşullardan biri olduğu bildirilmiştir. Nedeniyle karaciğer yağlanması ve obezite arasında güçlü ilişki nedeniyle, diyete bağlı obez (DIO) fare modelleri yaygın NAFLD 2, 3, 4, 5, 6 gelişimi ile ilişkili karmaşık moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılır. Hepatik steatoz NAFLD en erken aşamasıdır ve alkolsüz steatohepatit (NASH), siroz, ve sonuçta karaciğer kanseri 7 ilerleyebilir. Bu nedenle, bu yöntemin genel amacı karaciğer yağlanmış koşulların hayvan ve hücre modelleri oluşturmak ve pr içinverimli ve doğru lipit ölçümü için ovide ayrıntılı protokoller. Bu modeller ve ölçümleri de, insülin direnci, tip 2 diyabet gibi başka metabolik bozuklukların araştırılması için de yararlıdır.
obezite NAFLD, yüksek yağ faktörlerinden biri olduğu tespit gibi, yüksek sakarozlu diyet ile Batı tarzı yüksek yağlı diyet taklit (HFHS) farelerde, obezıteyi uyarmak için kullanılır. Daha sonra, hepatik steatoz derecesi farklı yöntemler kullanılarak değerlendirilebilir. İlk olarak, vücut ağırlığı ve nükleer manyetik rezonans (NMR), vücut kompozisyonu analizi zaman beslenme sırasında lipid birikimini gösterir. yağ kütlesi ve yağsız kitle non-invaziv ve gerçek zamanlı bir şekilde belirlenebilir.
Buna ek olarak, manyetik rezonans görüntüleme (MRG) tam vücut ve yağ karaciğer dağılımını hem göstermek için kullanılır. MR analizi gri tonlama sinyali okunaklı sözde renkli görüntüye dönüştürülür ve yoğunluğunun edilebilirgri tonlama ve renk hemi-ölçülebilir olduğunu. Bu teknoloji, canlı hayvanlarda lipid birikimi ölçümü için benzersiz avantajlar sağlamaktadır. İkinci olarak, karaciğerin histolojik analiz hepatik steatoz belirlemek için en sık kullanılan yöntemdir. Oil Red O boyama hepatositlerde lipid damlacıklarının boyutunu ve konumunu gösterirken Hematoksilen ve Eosin (H & E) boyama gibi hepatosit morfolojisi ve makrofaj infiltrasyonu olarak histolojik bilgi sağlar. Üçüncü olarak, kloroform / metanol ekstraksiyonu kullanılarak lipid içeriği analizi hepatik lipid doğru ve kantitatif ölçüsüdür. Toplam kolesterol ve trigliserid düzeyleri biyokimyasal yöntemler ile ölçülebilir. Önemli bir şekilde, lipit ekstraksiyon analizi ve Yağ Kırmızı O boya aynı zamanda genetik olarak manipüle ya da farmasötik açıdan kabul hepatositlerde kullanılabilir.
Bu yöntemin avantajı, karaciğer yağlanmış modelleri oluşturmak için birden fazla optimize yaklaşımların kullanılmasıdırve kapsamlı in vivo ve in vitro olarak, her iki fenotipleri karakterize etmek. DIO fare modelleri insan yağlı karaciğer hastalığının patolojisi ve metabolik fenotipleri özetlemek olabilir. İnsanlarda Diğer metabolik parametreler kuyu 8 olarak bu modelde çoğaltılmış olabilir. yüksek glukoz artı insülin yanıt olarak yağlanmış hepatosit modelinin oluşturulması yararlı verimli ve pahalı ve zaman alıcı bir fare çalışmanın sınırlama üstesinden gelir. Birlikte ele alındığında, bu yöntemler, bir besin yüklenme sonucu hepatik lipid bozukluğu ve insülin direnci çalışma için yeterli ve gereklidir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan deney protokolleri Biyolojik Bilimler Beslenme Bilimleri Enstitüsü, Şangay Enstitüleri, Çin Bilimler Akademisi (Şangay, Çin) kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından onaylandı.
1. DIO Fare Modeli
- HFHS besleme
- 40 kcal% yağ ve 40 kcal% sakaroz içeren bir HFHS ile sekiz haftalık erkek C57BL / 6 fareler besleyin. 12 saat karanlık-aydınlık döngüsünün koşulları onları ev.
- Dört onaltı hafta süreyle HFHS diyet beslenme durumunun fareler tutun. vücut ağırlığı haftalık kontrol edin.
- Vücut kompozisyon analizi ve sözde renkli görüntü analizi
- Bir vücut kompozisyonu analizörü analizi fareler Konu.
- bir plastik tüp içinde bilinçli değil, anestezi fareler sabitleyin. Daha önce 2 açıklandığı gibi, vücut yağ kütlesinin, yağsız kitle ve bir NMR sistemini kullanarak sıvıları ölçün.
- MRI sistemi kullanılarak her bir farenin tüm vücudu tarayın.
- intraperitoneal enjeksiyon (25 uL / g) ile 1% Avertin ile fareler anestezi ve uzman cam tüplerde görüntüleme analizini gerçekleştirmek.
Not: görüntüleme işlemi, her bir fare için yaklaşık 0.5 saat sürer. Ölçüm tamamlandığında, kendi kafesine fareler dönün.
- intraperitoneal enjeksiyon (25 uL / g) ile 1% Avertin ile fareler anestezi ve uzman cam tüplerde görüntüleme analizini gerçekleştirmek.
- dorsal, orta ve ventral katmanlardaki farelerin bütün organları tarama; dikey yönde karaciğer tarayın. Bir 0.55 T mıknatıs ve aşağıdaki enstrümantal parametreleri kullanın: taramalar K alanı = 192 x 256 mikron, kesit kalınlığı = 3 mm, TE = 14.8 ms, TR = 400 ms, FOVRead = 100 mm, FOVPhase = 100 mm ve numarayı = farelerin tüm gruplar için aynı manyetik koşulu ile 8. Tarama.
- Sinyal yoğunluğu 9'a göre bir sözde renkli görüntü üzerine gri tonlama görüntüyü Harita.
- Bir vücut kompozisyonu analizörü analizi fareler Konu.
- fare ötenazi
- Boru açma sterilizeBöyle forseps ve makas gibi ng araçları.
- Bir kağıt havlu üzerine yeterli izofluran dökün ve izofluran bir cam kavanoza uçucu edelim. Fareler izofluran ile ötenazi emin olun.
- bir işletim masaya fareler düzeltildi. % 75 etanol ile her karın Sprey makas kullanarak kılıç şeklinde bir süreç dermis bir kesi yapmak ve periton maruz elleriyle orta hat boyunca uzunlamasına dermis gözyaşı.
- forseps ile kılıç şeklinde sürecini Kelepçe ve iç organları açığa çıkarmak için kaburgaların altından geçerek periton enlemesine kesin.
- kalp ponksiyonu ile EDTA kaplı tüplerde kan toplamak.
- Karaciğer boyunca diyaframı kesin ve dikkatlice ince makas kullanarak enterocoelia karaciğeri çıkarın. Aşağıdaki Lipid ölçümleri için karaciğer dokusunun üç adet kesme H & E boyama için) 6 x 3 x 3 mm, b) yağ kırmızısı için 6 x 3 x 3 mm, kloroform karaciğer c) 20-40 mg / metanol çıkarma.
- H & E boyama
- 4 ° C gecede% 4 fosfat tamponlu formalin asetat karaciğer düzeltmek ve daha sonra parafin gömün.
- Daha önce 3, 10 açıklandığı gibi, parafin bölümleri (5 mikron) Kesme ve H & E boyama cam slaytlar takar.
- Yağ Kırmızı O boyamasıyla
- naip hazırlık
- % 10 formalin,% 60 izopropanol, hematoksilin ve gliserol jöle, Yağ Kırmızı O çalışma çözeltisi hazırlayın. izopropanol 100 mL, Yağ Kırmızı O tozu 0.5 g çözülür ve% 0.5 stok çözelti yapmak için bir 60 ° C banyo ısı.
- 2 oranında (GKD 2 O 3 stok çözeltisi ve 2 ml): bir 3 çift damıtılmış su (GKD 2 O) seyreltin. çalışma çözüm Filtre ve oda sıcaklığında en az 10 dakika bekletin.
- ap optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşik karaciğeri embedLastic gömme kutusu. 30 dakika boyunca -20 ° C'de dondur. Bir dondurma mikrotom 8 um bölümler halinde kesilmiş bir slayt doku monte edin ve 30 dakika için oda sıcaklığında bırakın.
- Bir boyama küvetin altındaki bir kağıt havlu yerleştirin ve kağıt havlu ıslak% 10 formalin dökünüz. boyama küvet slayt yerleştirin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca formaldehit buharları dondurulmuş bölümleri düzeltmek.
- 3 saniye süreyle boyama küvette% 60 izopropanol slayt batırın; kez tekrarlayın.
- Tüm doku kapağı ve 15 dakika boyunca inkübasyona slayt, Yağ Kırmızı O çalışma çözeltisinin bir kaç damla ekleyin. oda sıcaklığında ışıktan doku koruyun.
- 3 saniye süreyle boyama küvette yeni% 60 izopropanol slayt durulayın; İki kez tekrarlayın.
- Yavaşça iki kez distile su ile slayt durulayın ve doku etrafında su çıkarmak. doku kuru değil emin olun.
- 1 dakika boyunca Hematoksilen slayt yerleştirin ve 5-10 için musluk suyu ile hafifçe yıkayınMin. Yavaşça iki kez distile su ile slayt durulayın ve lamel koymak için hazır olana kadar distile su içinde tutmak.
- mikrodalga gliserol jöle ısıtın ve doku üstüne birkaç damla koyun. Yavaşça üstüne lamel yerleştirin ve kabarcıkları oluşturmak için özen gösterin.
- mikroskop altında leke gözlemlemek ve 20X ve 40X hedefleri kullanarak karakteristik resimler yakalamak.
- naip hazırlık
- Karaciğer yağı ölçümü
- Yeni 2-mL'lik plastik bir santrifüj tüpü içinde parçalara karaciğer doku yerleştirin. homojenleştiricisi olan 1 mL PBS içinde homojenize ve yeni bir 15 ml'lik cam tüp lizat aktarın.
- kuvvetle 1 dakika boyunca (1, h / h 2) çözeltisine, girdap karışımı, buz üzerinde 2 saat boyunca bekletilmiştir kloroform / 5 mL metanol ilave edin.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1,650 x g'de santrifüje tabi tutulur; Üst metanol tabakası, orta protein disk ve alt kloroform ve lipidler: karışım 3 katmanlara ayırmak gerekir.
- tran Bir cam Pasteur pipet kullanılarak yeni bir cam tüp içine alt faz Sfer; alt fraksiyonun her damla almak için gerek yoktur. buz üzerinde bir kenara tüp ayarlayın.
- Kuvvetli bir şekilde bir önceki boru ve vorteks kalan yüzer madde bölümlerinde kloroform 4 mM MgCl2 ve 1.5 ml olan 600 ul ekle. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1,650 x g'de 30 dakika boyunca buz ve santrifüj üzerinde inkübe edin.
- Pasteur pipet kullanarak ilk alt aşama tüp ile alt faz birleştirin. üst ve orta tabakalar atın.
- 37 ° C banyo azot gazı altında kloroform buharlaştırın. % 1 Triton X-100 / kloroform, 200 uL ile iyice cam tüpler kenarlarını yıkayın (hac / hac). azot gazı altında buharlaştırılır. Nihai emülsiyon yapmak için iyi 200 GKD 2 O uL ve vorteks ile lipid eritin.
- üreticinin protokolüne uygun olarak bir trigliserit veya kolesterol kiti kullanılarak toplam trigliserit (TG) ve kolesterol (TC) seviyelerini ölçmekxref "> 3.
Not: Protein miktarının 3 ile belirlendiği gibi lipit miktarı, başlangıç Homojenat protein konsantrasyonları kişilerce normalleştirilir.
2. İlköğretim Fare Hepatosit Modeli
- Fare primer hepatositlerinde İzolasyonu
- % 6 kloral hidrat (intraperitoneal 10 mL / g) ile her fare anestezisi.
- Daha önce tarif edildiği gibi 10, birincil hepatositler izole edin. Yağ Kırmızı O boyamasıyla bir 6-yuvalı plaka içinde, kolajen kaplanmış cam lameller üzerine hücreler büyür. Lipid ekstraksiyonu için, 10 cm'lik bir hücre kültür kabı 10 üzerine hücreleri tohum.
- Hücre tedavisi ve Yağ Kırmızı O boyama
- starvasyon ortamı 2 mL orta yerine 24 saat süreyle 37 ° C'de inkübe edin. 30 mM glukoz, 100 nM insülin ile tedavi edin. 24 saat boyunca 37 ° C kültürü inkübatöründe inkübe.
- orta aspire. 2 mL PBS ekleyin ve orta durulama yavaşça girdap; kez tekrarlayın.
- Bir lastik bant ile slayt lamel sabitleyin. dış yüzeyine yapışık hücreleri Açığa. (Adım 1.5) de yukarıda tarif edildiği gibi yağ kırmızısı gerçekleştirin.
Not: Lipid birikimi bazal seviyeleri, serum açlığından sonra yüksek glukoz artı insülin tedavisi çoğu ile uyarılmaktadır. lipit damlaları Oil Red O lekeleme tarafından görüntülenmiştir.
- Lipidlerin ölçüm
- Aynı durumda yüksek glukoz artı insülin (adım 2.2.1) ile hepatositler davranın. Her 10 cm hücre kültürü çanağı PBS 1 ml. hücreler kazıma ve onları 100 uL tam bölünen miktarları, protein ölçülmesi için yeni bir 1.5 ml tüplere aktarılır olan yeni bir 15-ml cam tüpler içine hasat edilir.
- kalan diğer hücreleri 900 uL (1, hac / hac 2) 4 ml kloroform / metanol ekleyin. Yaklaşık 20 bip sesi için ses dalgalarına maruz ve sonra vorteks şiddetle serbest bırakmak içinhücrelerde lipid. 2 saat süreyle buz üzerinde inkübe karışımı. Lipid ekstraksiyon (adım 1.6) gerçekleştirin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1A'da gösterildiği gibi, fare vücut ağırlığı yaklaşık yemi besleme diyet grubuna göre 1.5 kat olan HFHS besleme, 16 hafta sonra 45 ± 1.2 g arttırılmıştır. NMR vücut kompozisyonu yağ kitlesini ve farelerin yağsız kitle gösteren analizleri (Şekil 1B) gösterilir. Tüm vücut ve karaciğer yağ dağılımı MRG ile tespit edilmiştir ve canlı, bilinçli farelerde temsilcisi sözde renkli görüntüler Şekil 1C-D gösterilmiştir. vücut ağırlığı ve...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
NAFLD metabolik sendrom, obezite, insülin direnci, ya da tip 2 diabetes mellitus (T2DM) 11 ile ilişkili olan ilerleyici karaciğer hastalıklarının bir dizi. NAYKH'nın damgasını yağlanma, hepatositlerde lipid birikimidir. Burada, yöntemler spektrum fenotipleri ve DIO fare ve fare primer hepatositlerde kullanarak hepatik steatoz parametrelerini tanımlamak için sunulmuştur. Bu prosedür NAYKH ve diğer ilgili metabolik hastalıkların moleküler mekanizmaları aydınlatmak için yararlı olabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Finansman: Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilim Vakfı (No. 81270930, 31471129, 31671224 ve) ve yüz Yetenekler Çin Bilimler Akademisi Programı (2013OHTP04) YL için hibe ile desteklenmiştir
Teşekkürler
Yararlı tartışmalar için Feifei Zhang'a teşekkür ederiz. Teknik yardım için Jing Gao ve Yixuan Sun'a ve hayvan çalışmaları için Zhengshuai Liu ve Fengguang Ma'ya minnettarız.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| OCT bileşiği | SAKURA | 4583 | |
| Yağ Kırmızısı O | Sigma | O0625-25G | |
| Sonsuzluk Trigliserit kiti | Fisher Bilimsel | TR22421 | |
| Sonsuzluk Kolesterol kiti | Fisher Bilimsel | TR13421 | |
| Kollajen tip I, Sıçan kuyruğu | Millipore | 08-115 | |
| DMEM (düşük glikoz) | İnvitrojen | 11885-092 | |
| Penisilin / Streptomisin | İnvitrojen | 15140-122 | |
| FBS | İnvitrojen | 10099141 | |
| PBS | cellgro | R21-040-CVR | |
| HBSS | cellgro | 20-021-CV | |
| İnsülin | TOCRIS Bioscience | 3435 | PBS'de çözülür, stok için 1 mM |
| Glikoz | Sigma | G8270-100G | |
| Mikroskop | Olympus | BX53 | |
| Peristaltik pompa | Longerpump | BT100-2J | |
| 10 cm hücre kültürü kabı | Corning | 420167 | |
| 6 kuyulu plaka | Corning | 3516 | |
| BCA testi | Beyotime | P0010 | |
| Nükleer Manyetik Rezonans | Niumag teknolojisi | MiniQMR23-060H-I | |
| Yüksek yağlı yüksek surkoz diyeti (HFHS) | Araştırma Diyetleri | D12327 |
Kaynaklar
- Angulo, P. Medical progress - Nonalcoholic fatty liver disease. New England Journal of Medicine. 346 (16), 1221-1231 (2002).
- Chen, X., et al. Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha. Diabetes. 65 (7), 1904-1915 (2016).
- Li, Y., et al. AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice. Cell Metab. 13 (4), 376-388 (2011).
- Li, Y., et al. Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21. Gastroenterology. 146 (2), 539-549 (2014).
- Esau, C., et al. miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting. Cell Metabolism. 3 (2), 87-98 (2006).
- Kanda, H., et al. MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity. Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).
- Cohen, J. C., Horton, J. D., Hobbs, H. H. Human fatty liver disease: old questions and new insights. Science. 332 (6037), 1519-1523 (2011).
- Hebbard, L., George, J. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 35-44 (2011).
- Chen, Y., et al. Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier. Biomaterials. 35 (38), 10058-10069 (2014).
- Gong, Q., et al. Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice. Hepatology. 64 (2), 425-438 (2016).
- Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (6), 330-344 (2013).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
