髂动脉球囊损伤的兔动脉粥样硬化加速模型：方法学视角

摘要

动脉粥样硬化的动物模型对于理解其发病机制以及探索预防斑块形成或破裂的新方法至关重要，而斑块破裂是工业化国家主要的死亡原因之一。本方案采用球囊损伤联合高胆固醇饮食的方法，在兔髂动脉中诱导形成动脉粥样硬化斑块。

摘要

由动脉粥样硬化斑块形成及破裂导致冠状动脉闭塞所引发的急性冠脉综合征，是工业化国家死亡的首要原因。新西兰白兔（New Zealand White, NZW）被广泛用作动脉粥样硬化研究的动物模型。当喂食致动脉粥样硬化饮食时，它们可自发形成病变，但通常需要4至8个月的较长时间。为了进一步促进并加速动脉粥样硬化进程，常采用致动脉粥样硬化饮食联合机械性血管内皮损伤的方法。本文所述的在兔子中诱导动脉粥样硬化斑块的方法，采用球囊导管对喂食致动脉粥样硬化饮食的新西兰白兔左侧髂动脉内皮进行损伤。球囊导管造成的机械性损伤会引发一系列炎症反应，并以时间依赖的方式启动新生内膜的脂质积聚。球囊损伤后形成的动脉粥样硬化斑块表现为新生内膜增厚，伴有广泛的脂质浸润、丰富的平滑肌细胞以及来源于巨噬细胞的泡沫细胞。该技术操作简便、可重复性强，可在髂动脉内产生长度可控的斑块。整个操作过程在20至30分钟内完成，安全性高，死亡率低，且能高效获得显著的内膜病变。通过球囊导管诱导的动脉损伤可在两周内形成动脉粥样硬化病变。该模型可用于疾病病理机制的研究、诊断成像以及新型治疗策略的评估。

引言

易损动脉粥样硬化斑块的破裂是工业化国家死亡的主要原因之一¹。尽管过去几十年的研究已揭示了参与斑块进展的多种分子和细胞机制，但仍需持续努力，不仅进一步阐明疾病进展的复杂机制，同时也为测试新的治疗方法提供支持。已有多种动物模型被用于动脉粥样硬化的研究。遗传操作、高胆固醇饮食或机械性内皮损伤是大多数动脉粥样硬化动物模型（包括小鼠、家兔和小型猪）常用的策略。其中，新西兰白兔（NZW兔）对胆固醇饮食敏感，而正常大鼠和小鼠对膳食胆固醇的吸收不显著^2,3,4。当饲以富含胆固醇的饮食时，家兔会自发形成富含巨噬细胞并含有一定纤维成分的主动脉病变^5,6。然而，单纯通过高胆固醇饮食诱导动脉粥样硬化斑块需要长达4至8个月的准备时间^6,7，这在大多数实验条件下是一个主要缺点。为了在相对较短的时间内诱导病变，Baumgarter和Studer开发了一种结合高胆固醇饮食与球囊损伤的方法⁸。该技术的总体目标是在高胆固醇血症家兔中，于2周内诱导形成主要由....

方案

本实验方案已获得瑞士弗里堡州兽医办公室和瑞士联邦兽医办公室的批准（FR 2015/58）。

注意：选用体重在 2.8 至 3.2 kg 之间的雄性新西兰白兔。动物在常规条件下饲养（12 小时光照与 12 小时黑暗循环，自由饮水和进食）。在球囊去内皮手术前，动物适应环境 1 周，期间饲喂普通饲料。经过 1 周的适应期后，兔子在整个研究期间转为致动脉粥样硬化饮食，该饮食含有高脂肪（8.6%）、饱和脂肪酸及含胆固醇（205 mg/kg，即 1%）的饲料。在开始饮食干预 1 周后，对左侧髂动脉进行球囊损伤操作，动物分别在球囊损伤后 2 周或 4 周处死。

1. 术前操作步骤

1. 使用玻璃珠灭菌器或其他合适的器械，在使用前对所有外科手术器械进行灭菌。
2. 准备并检查球囊导管组件。
   1. 将一支装有生理盐水的1 mL鲁尔锁式注射器连接至球囊导管的鲁尔锁接口。仔细检查并确保无残留空气。通过推动注射器活塞检查有无泄漏，并确认球囊正常充盈。
3. 称量兔子体重，并将加热垫调至 37 °C。
4. 使用浓度为 0.3 mg/ml 的丁丙诺啡溶液，皮下注射，剂量为 0.01 mg/kg。
5. 用5%异氟烷和5 L/min氧气麻醉兔子₂ 在诱导室中放置 10 - 15 分钟。
6. 将....

结果

髂动脉球囊损伤操作成功完成，未发生并发症（图1）。仅对一侧髂动脉进行损伤时，总手术时间介于20至30分钟之间；对双侧动脉进行损伤时，手术时间为35至45分钟。兔在球囊损伤后1小时内恢复。所有动物均表现健康，无明显体重下降。未出现感染、水肿或动脉血栓。除缝合部位存在轻度纤维化外，伤口区域正常。经过4周致动脉粥样硬化饮食喂养后，兔的胆固醇水平升高，达到44 ± 18 mM/L。

图2A、图2E 和 图2I 显示右侧未受伤的髂动脉（未进行球囊损伤）具有正常形态。球囊损伤联合高胆固醇饮食在两周内引起血管壁的结构改变，导致动脉粥样硬化斑块的形成（图2 和 图3）。未受伤和球囊损伤的髂动脉取自同一动物。球囊损伤引发的增殖性血管反应作为触发.......

讨论

兔髂动脉粥样硬化模型在动脉粥样硬化研究中被广泛应用。与仅通过高胆固醇饮食诱导的自发性病变相比，采用本方案可使兔子迅速形成更严重且更晚期的斑块。重要的是，动物在手术后能够快速恢复。

动脉粥样硬化形成的主要刺激因素是球囊导管造成的机械性损伤，这种损伤会损害内皮并扩张血管壁²⁶。该操作会引发一种重塑反应，其特征是出现炎症，伴随巨噬细胞募集和脂质积聚（当联合高胆固醇饮食时），以及血管平滑肌细胞的迁移与增殖、基质合成增强，并随时间推移形成侵袭性新生内膜^15,16。插入球囊导管是该操作中最关键的步骤。必须谨慎操作，避免用力强行插入球囊。采用外周隐静脉通路进入髂总动脉可简化技术流程。也可通过颈动脉切开途径进入髂动脉，如先前文献所述^27,28。然而，经颈动脉途径评估髂动脉需要较高的外科技术水平，并需额外设备，例如血管造.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
新西兰白兔	Charles River Laboratories，法国	Cre:KBL(NZW)
高胆固醇饮食	Ssniff spezialdiäten	Ssniff EF K 高脂高胆固醇饲料
玻璃珠灭菌器-Germinator 500	VWR，英国莱斯特郡	101326-488
Fogarty球囊取栓导管，2 法规格	Edwards Lifesciences，瑞士	120602F	仅限一次性使用
Luer Lock 注射器	Becton, Dickinson and Company，美国	309628
Thermopad Type 226	Solis，瑞士 AG	397387
布托啡诺-Temgesic	Reckitt Benckiser AG，瑞士	7.68042E+12
异氟烷	Piramal Critical Care, Inc, Bethlehem, PA 18017，美国	2667-46-7
麻醉机-combi-vet Base 麻醉系统	Rothacher Medical GmbH，瑞士	CV 30-301-A
Cardell touch 兽用生命体征监护仪	Midmark，美国俄亥俄州	8013-001
眼科软膏-Humigel	Virbac，法国
动物毛发剪毛器	Aesculap AG，德国	GT420
消毒剂-聚维酮碘溶液	Mundipharma Medical Company，瑞士	14671-1203
Dumont #7 镊子	FST 德国	11274-20
中号和小型显微剪刀	Medline International Switzerland Sàrl	UC4337
微血管夹	FST，德国	18051-28
罂粟碱	ESCA chemicals，瑞士	RE 356 803
静脉剥离钩	Harvard Apparatus，英国剑桥	72-4169	仅限一次性使用
生理盐水	Laboratorium Dr. G. Bichsel AG，瑞士	1330055
Polysorb 5-0 缝线	Covidien AG，瑞士	UL 202	单股缝线
磺胺多辛和甲氧苄啶-Trimethazol	Werner Stricker AG，瑞士	Swissmedic Nr. 50'361
抗菌剂-Octenisept	Schülke & Mayr AG，瑞士	GTIN: 4032651214068
磷酸盐缓冲液	Roth	1058.1
异丁醇-2-甲基丁烷	Sigma-Aldrich，瑞士	M32631-1L
最佳切割温度包埋剂-Tissue-Tek	VWR Chemicals，比利时	25608-930
冷冻切片机	Leica，瑞士格拉特布鲁格	Leica CM1860 UV
载玻片-Superfrost Plus	Thermo Scientific	4951PLUS4
Mayer 苏木精染液	Sigma-Aldrich，瑞士	MHS32-1L
0.5% 水溶性伊红	Sigma-Aldrich，瑞士	HT110232-1L
油红 O	Sigma-Aldrich，瑞士	O0625-25G
α-平滑肌肌动蛋白抗体	Abcam，英国	ab7817
巨噬细胞克隆 RAM11 抗体	DAKO，瑞士	M063301
Hoechst 染色剂	Abcam，英国	ab145596
山羊多克隆二抗（Chromeo 546）	Abcam，英国	ab60316
Alexa Fluor 488/547	Abcam，英国
甘油明胶封片介质（水性）	DAKO，瑞士	C056330
Movat 五色染色用苏木精	Sigma-Aldrich，瑞士	H3136-25G
Movat 五色染色用氯化铁	Sigma-Aldrich，瑞士	157740-100G
Movat 染色用碘	Sigma-Aldrich，瑞士	207772-100G
Movat 五色染色用碘化钾	Sigma-Aldrich，瑞士	60400-100G-F
Movat 染色用阿尔新蓝	Sigma-Aldrich，瑞士	A5268-10G
Movat 五色染色用浓氨水	Sigma-Aldrich，瑞士	320145-500ML
Movat 五色染色用亮克罗辛 MOO	Sigma-Aldrich，瑞士	210757-50G
Movat 五色染色用酸性品红	Sigma-Aldrich，瑞士	F8129-50G
Movat 五色染色用硫代硫酸钠	Sigma-Aldrich，瑞士	72049-250G
Movat 五色染色用磷钨酸	Sigma-Aldrich，瑞士	79690-100G
Movat 五色染色用藏红	Sigma-Aldrich，瑞士	17304-5G
Movat 五色染色用 EUKITT 封片剂	Sigma-Aldrich，瑞士	03989-100ML