نقدم بروتوكول باستخدام طريقة تلوين جولجي كوكس في أقسام الدماغ سميكة، من أجل رؤية الخلايا العصبية مع أشجار شجيري طويلة الواردة في عينات الأنسجة واحدة. يتم عرض نوعين مختلفين من هذا البروتوكول أيضا التي تنطوي على الكريزيل البنفسجي counterstaining، وتجميد العقول غير المجهزة لتخزين على المدى الطويل.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الخلايا العصبية التصوير داخل أقسام الدماغ سميكة باستخدام أسلوب جولجي كوكس
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد استخدمت طريقة جولجي كوكس من تلطيخ الخلايا العصبية لأكثر من مائتي عام لتعزيز فهمنا للمورفولوجيا الخلايا العصبية داخل الدماغ العينات النسيجية. في حين أنه من الأفضل من الناحية العملية لإعداد أقسام الدماغ في أكبر سمك ممكن، من أجل زيادة احتمال تحديد الخلايا العصبية الملون التي ترد بشكل كامل داخل الأقسام واحدة، وهذا النهج هو محدود من منظور تقني من العمل لمسافات عالية ، تكبير أهداف المجهر. ونحن هنا التقرير بروتوكول لصبغ الخلايا العصبية باستخدام طريقة جولجي كوكس في أقسام مخ الفأر أن يتم قطع في 500 سمك ميكرون، وتصور الخلايا العصبية في جميع أنحاء عمق هذه المقاطع باستخدام المجهر تستقيم مزودة عالية الدقة 30X 1.05 NA سيليكون هدف النفط الغمر يحتوي على مسافة العمل 800 ميكرون. نحن أيضا الإبلاغ عن الخيارين مفيدة من هذا البروتوكول التي يمكن استخدامها لمباين سطحشنت أقسام الدماغ مع نيسل وصمة عار الكريزيل البنفسجي، أو لتجميد العقول كلها للتخزين طويل الأجل قبل باجتزاء والتجهيز النهائي. بروتوكول الرئيسي ومشتقاته اثنين تنتج أقسام الدماغ سميكة الملون، في جميع أنحاء الذي الكاملة أشجار الخلايا العصبية شجيري والعمود الفقري تغصناته يمكن تصور موثوق وكميا.
المقدمة
التصور من الخلايا العصبية الفردية داخل عينات الأنسجة يسمح للفي الموقع تحليل الخصائص المورفولوجية الخلايا العصبية، التي تقدمت بشكل كبير من فهمنا للدماغ وكيف يمكن أن يتأثر بها المرض الذاتية أو العوامل البيئية الخارجية. طريقة تلوين جولجي كوكس هو، وسيلة فعالة من حيث التكلفة بسيطة نسبيا من تلطيخ عينة عشوائية من الخلايا العصبية في الدماغ. أول من وضعه جولجي 1 وتعديلها من قبل كوكس 2 في 1800s، ومزيد من الصقل الباحثون هذه التقنية على مر السنين لإنتاج واضحة، والخلايا العصبية الملون بشكل جيد والتي يمكن استخدامها لتصور وتحديد كلا مورفولوجيا الشجرة شجيري وكثافة العمود الفقري
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم استخدام الكبار للإناث الفئران CD1 سلالة في هذه الدراسة. تلطيخ مماثل يمكن تحقيق ذلك باستخدام كلا الجنسين في مختلف الأعمار. ويهتم حيوانات التجارب لوفقا لمبادئ وتوجيهات من المجلس الكندي لرعاية الحيوان، وتمت الموافقة على بروتوكول تجريبي من قبل الجامعة لجنة رعاية الحيوان جويلف.
1. جولجي كوكس تلطيخ
- جولجي كوكس إشباع العقول
- جعل الحل جولجي كوكس 1٪ (ث / ت) ثاني كرومات البوت....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يجوز استخدام هذا البروتوكول تلطيخ جولجي كوكس وصفهما مشتقاته اختياري لتصور الخلايا العصبية الفردية داخل 400-500 ميكرون أقسام الدماغ سميكة. وتظهر صورة مركبة تمثيلية اثنين من الأبعاد Z-توقعات استولت باستخدام الهدف 10X و 5 ميكرومتر الخطوات في محور Z في الشكل 1: A1 - C1 لمنطقة واسعة من أقسام الدماغ الاكليلية التي تتضمن الحزامية الأمامية منطقة القشرة 1 و القشرة الحركية الثانوية 18. قطعت أقسام في 500 ميكرون. لاحظ أ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نحن هنا وصف بروتوكول تلطيخ جولجي كوكس جنبا إلى جنب مع اثنين من المتغيرات مفيدة لتصور الخلايا العصبية داخل أقسام الدماغ سميكة. كما هو مبين في ممثل النتائج، واستخدام هدفا عالية الدقة لديه طويلة المسافة 800 ميكرون العمل يسمح التصور يمكن الاعتماد عليها من الخلايا العصبية كامل في جميع أنحاء عمق أقسام الدماغ قطع في 500 ميكرون. هذه الدراسة من أقسام الدماغ سميكة نسبيا يزيد من احتمال أن الخلايا العصبية الملون من أي نوع ترد بشكل كامل داخل شريحة، وهو أمر مهم خاصة بالنسبة للخلايا العصبية الهر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل منحة ديسكفري إلى CDCB من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC)، وجون ريس ايفانز صندوق قادة منحة البنية التحتية البحثية لCDCB من المؤسسة الكندية للابتكار (CFI مشروع رقم 30381)، و منحة ديسكفري إلى NJM من NSERC. وأيد ELL عن طريق منح الدراسية أونتاريو العليا وعن طريق منح الأيتام والأطفال الضعفاء من كلية أونتاريو البيطري في جامعة جيلف. وأيد CDS عن طريق مساعدة مالية البحوث الجامعية الطالب من NSERC. وأيد ALM عن طريق منح الكسندر غراهام بيل من NSERC وقبل منح الأيتام والأطفال الضعفاء من كلية أونتاريو البيطري في جامعة جيلف.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ثنائي كرومات البوتاسيوم | فيشر Scientific | P188-100 | |
| كرومات البوتاسيوم | فيشر Scientific | P220-100 | |
| كلوريد الزئبق | فيشر Scientific | S25423 | ورق |
| ترشيح واتمان الخطير من الدرجة 1 | فيشر Scientific | 1001-185 | |
| شركاء الأيزوفلوران | الصيدلانيون في كندا | CP0406V2 | |
| 20 مل قارورة التلألؤ | فيشر Scientific | 03-337-4 | |
| السكروز | Bioshop Canada | SUC700.1 | |
| فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة | Sigma Aldrich | S5011-500G | |
| فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة | Sigma Aldrich | S9390-500G | |
| 50 مل أنبوب مخروطي | الشكل فيشر Scientific | 12-565-271 | |
| isopentane | فيشر Scientific | AC126470010 | المعروف أيضا باسم 2-methylbutane ؛ أجار خطير |
| سيجما ألدريتش | A1296-100G | ||
| طبق وزن صغير | فيشر ساينتفيك | 02-202-100 | |
| اهتزاز | Leica | VT1000 S | |
| 6 آبار لوحات زراعة الأنسجة | فيشر Scientific | 08-772-1b | |
| شبكة أسفل الأنسجة إدراج | فيشر Scientific | 07-200-214 | |
| paraformadelhyde (PFA) ، 16٪ | علوم المجهر الإلكتروني | 15710-S | |
| هيدروكسيد الأمونيوم | فيشر Scientific | A669S-500 | كوداك الخطرة |
| A | Sigma Aldrich | P7542 | |
| superfrost plus شرائح | فيشر Scientific | 12-550-15 | |
| عامل مقاصة CitroSolv | فيشر ساينتفيك | 22-143-975 | |
| الكحول الإيثيلي اللامائي | الكحوليات التجارية | N / A | |
| كريسيل البنفسجي | سيجما ألدريتش | C1791 | |
| permount | فيشر Scientific | SP15-100 | |
| مجهر مستقيم | أوليمبوس | نموذج BX53 | |
| كاميرا ملونة ، 12 بت | MBF Biosciences | DV-47d | QImaging جزء 01-MBF-2000R-F-CLR-12 |
| مرحلة مجهر آلي ثلاثي الأبعاد ، وحدة تحكم و enoders | MBF Biosciences | N / A | يتم توفيرها ودمجها بالمجهر بواسطة MBF Biosciences |
| 4X مجهر الهدف | أوليمبوس | 4x 0.16 NA UplanSApo | |
| 10X المجهر الموضوعي | أوليمبوس | 10x 0.3 NA UPlan FL N & nbsp ؛ | |
| هدف المجهر 30X | أوليمبوس | 30x 1.05 NA UPlanSApo | |
| هدف المجهر 60X | أوليمبوس | 60 × 1.42 NA PlanAPO N | |
| زيت غمر السيليكون | أوليمبوس | Z-81114 | |
| برنامج Neurolucida | MBF Biosciences | الإصدار 10 | |
| برنامج ImageJ | المعاهد الوطنية للصحة | الإصدار الحالي | مع البرنامج المساعد OME Bio-Formats |
| Photoshop | المثبتإصدار Adobe | CS6 |
المراجع
- Golgi, C. Sulla struttura della sostanza grigia del cervello. Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).
- Cox, W. H. Imprägnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen. Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).
- Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox Staining Step by Step....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
