原代小胶质的快速和精细的CD11b电磁隔离带增强的纯度和多功能性

Summary

这里，我们提出用于体外实验的协议来隔离来自出生后小鼠幼仔的小胶质细胞（1天）。此简易分离方法产生了高收率和纯度，在替代方法一个优点显著允许阐明小胶质生物学的目的范围广泛的实验。

Abstract

小胶质细胞是主要的反应，以中枢神经系统损伤;然而，还有许多关于他们在调节神经炎症的作用尚不清楚。小胶质细胞是功能类似于在巨噬细胞炎性测量应力中胚层细胞。经典的（M1型）和替代（M2型）的巨噬细胞的激活也已经扩展到小神经胶质细胞中是为了更好地理解下面的相互作用这些表型具有在神经炎性病症​​，例如帕金森氏，阿尔茨海默氏症，和亨廷顿氏病。 体外实验利用初级小胶质细胞提供了可以扩展到体内环境的快速和可靠的结果。虽然这是在体内实验具有明显的优势，隔离的小胶质细胞而实现最佳的纯净，足够的产量一直是个挑战。目前使用的常用方法无论是从回收率低，纯度低，或两者受苦。在此，我们高程模型onstrate该实现中的时间量的一半高的细胞回收和提高的纯度的无柱的CD11b磁分离方法的改进。我们建议这种方法优化为主的小胶质细胞分离为研究神经炎症和神经退行性病变的目的非常有用的模型。

Introduction

小胶质细胞是中胚层起源的MYB-亚独立定居巨噬细胞，其选自c-kit + / CD45 -分化erythromyeloid在卵黄囊^1，2的血岛祖细胞。一旦胚胎的小胶质细胞已定植的中枢神经系统（CNS），它们从一个变形虫过渡到网状形式^3。因为它们的动态后果探测潜在的侮辱⁴良性脑实质这些成人小胶质细胞被列为监视者。虽然小胶质细胞只向CNS细胞群的约10％，其以瓦能力彼此之间确保了实质^4,5的最大扫描。危险相关的分子模式（DAMP的），如α突触核蛋白^6,7和淀粉样蛋白^β8，或对athogen相关分子模式（PAMP），如脂多糖^{（LPS）9，}经典激活的小胶质细胞，以促进其特征在于，回复到变形虫活动状态，产生一氧化氮，肿瘤坏死因子α（TNFα），白介素1β的炎症反应（IL-1β），IL-6，IL-12，和趋化因子CC基序配体2

Protocol

动物和协议的程序使用批准和机构动物护理和使用委员会（IACUC）在爱荷华州立大学（埃姆斯，IA，USA）的监督

1.混合胶质细胞培养物的种植

1. 迅速斩首1-2日龄幼仔用5.5英寸操作剪刀，并立即放置在头冰上的50毫升管中。请注意，这是断头安乐死的方式。
2. 在层流气流罩，使在颅骨和使用4.5英寸直微解剖剪脑膜一个小切口。开始从尾端切割喙端（鼻）。通过使用由断头形成的开口获取的皮肤下面。
   1. 切口后，剥离半球一侧的一个。然后使用一对弯曲的或钩状镊子的删除整个大脑。
3. 沉浸大脑（一个或多个）在含有0.25％胰蛋白酶ethylenediaminetetraacet新50mL试管在37℃水浴中吃15分钟乙酸（EDTA）。使用2毫升每脑胰蛋白酶-EDTA的。
4. 通过添加和删除的新鲜生长培养基（10％FBS，DMEM / F12，1％青霉素/链霉素，1％L-谷氨酰胺，1％丙酮酸钠和1％非必需氨基酸）洗涤脑（S）媒体。重复此4倍。
5. 对于每个脑，板含有生长培养基两个T-75烧瓶中。因此，每个脑加入2毫升的生长培养基到管上。因此，这将是1毫升脑匀浆中的与8-9毫升，每T-75烧瓶中的生长培养基的等效。
6. 通过研磨脑（或多个）具有不同开口尺寸的移液管，以便从最大到最小均化。当它是可见的大脑组织没有变小，过渡到下一个吸....

Results

小神经胶质细胞使用细胞CD11b阳性选择试剂盒分离II具有高纯度

原代小鼠的小胶质细胞使用上述方案分离并接种于聚-D-赖氨酸包被的盖玻片上，以检查隔离的纯度。每孔和免疫细胞化学分析铺板万个细胞使用离子化的钙结合适配器分子1（Iba1）作为小胶质细胞和神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）作为星形胶质细胞的标记物的标记物以检查所述分离的小胶质细胞的纯度进行。离体培养中表达只无Iba1 GFAP的表达（ 图2A），表明培养物中分离是纯的小胶质细胞。不同于初级小胶质细胞的分离，取得纯度〜97％其它先前公布的方法，使用这种方法，我们在一半的时间得到的〜> 99％纯度。为了进一步验证日的纯度是文化，我们进行了印迹²⁰ Iba1和GFAP。免疫印迹分析进一步揭示了从混合胶质细胞培养这种隔离是几乎纯的小胶质细胞培养物（ 图2B.......

Discussion

旧版小胶质细胞的分离方法具有有限的回收率关于各种蛋白通过Western印迹分析和RNA通过qRT-PCR分析是不恰当的。差分的粘附性和温和的胰蛋白酶消化的方法是具有低的小神经胶质收率^13，14，15两种常用的方法。基于列的CD11b的方法也有低回收率，但实现了比差的粘附性和温和的胰蛋白酶消化^{13，14，15，16，17}更高的纯度。我们最初的无柱的CD11b的方法极大地提高了的分离产率，使其适合于蛋白质和RNA如Western印迹和qRT-PCR分析这样，但在成本纯度¹⁵下降。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
EasySep CD11b 分离试剂盒 II	StemCell Technologies	18970
EasySep 磁力	StemCell Technologies	18000
DMEM/F12 （1：1） （1x）	Life Technologies	11330057
丙酮酸钠	Life Technologies	11360070
MEM 非必需氨基酸 （100x）	Life Technologies	11140050
L-谷氨酰胺 （100x）	Life Technologies	25030081
EDTA	Fisher Scientific	AM9260G
胎牛血清 （FBS）	Sigma	13H469
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco by Life Technologies	25200
Dulbecco's PBS （DPBS）	Gibco by Life Technologies	14190250