cultivo de órgano entero del disco intervertebral (DIV) conserva la matriz extracelular nativa, fenotipos de células, y las interacciones celulares-matriz. A continuación se describe un sistema de cultivo IVD utilizando lumbar del ratón y IVD caudales en sus unidades funcionales de la columna vertebral y varias aplicaciones que utilizan este sistema.
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En este artículo
Resumen
Resumen
disco (IVD) degeneración intervertebral es un contribuyente significativo al dolor de espalda baja. El IVD es una articulación fibrocartilaginous que sirve para transmitir y amortiguar las cargas en la columna vertebral. El IVD consiste en una pulposo rica en proteoglicanos núcleo (NP) y un anillo de fibrosis rico en colágeno (AF) insertado por placas extremas cartilaginosas. Junto con las vértebras adyacentes, la estructura de vértebras-IVD forma una unidad columna vertebral funcional (FSU). Estas microestructuras contienen tipos de células únicas, así como matrices extracelulares únicos. cultivo de órgano entero de la FSU conserva la matriz extracelular nativa, fenotipos de diferenciación celular, y las interacciones celulares-matriz. Por lo tanto, las técnicas de cultivo de órganos son particularmente útiles para la investigación de los complejos mecanismos biológicos de la IVD. A continuación, describimos un enfoque de alto rendimiento para el cultivo de toda UFA ratón lumbar que proporciona una plataforma ideal para el estudio de los mecanismos y las terapias de enfermedades para el IVD. Además, describimos saplicaciones everal que utilizan este método de cultivo de órganos para llevar a cabo estudios adicionales incluyendo imágenes microCT contraste mejorado y tridimensionales de alta resolución de elementos finitos modelado de la IVD.
Introducción
El dolor lumbar (LBP) es el factor principal para la discapacidad global y la pérdida de productividad en el lugar de trabajo, y sólo los estadounidenses gastan más de 50 mil millones de dólares en el tratamiento LBP 1. Aunque prevalece, la etiología del dolor lumbar sigue siendo compleja y multifactorial. Sin embargo, el disco intervertebral (DIV) degeneración es uno de los factores de riesgo más importantes para la LBP 2.
El IVD está hecho de tres microestructuras: la fibrosis exterior del anillo (AF), el núcleo interior pulposo (NP), y dos placas terminales cartilaginosas ese sándwich tod....
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Protocolo
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Universidad de Washington en el Comité de Estudios en animales St. Louis.
1. Los animales
- Obtener dos cepas de ratones: 10-semanas de edad BALB / c (n = 6, BALB-M, BALB / cAnNTac) y 10 semanas de factor nuclear animales reportero kappa-B-luciferasa de edad (NF-κβ-luc) criados en una BALB / c de fondo (n = 6, BALB / c-Tg (Rela-luc) 31Xen).
- Antes de la disección, la eutanasia a los animales con CO 2 sobredosis a un caudal de 2,5-3 L / min durante 5 min seguido por un 2 minutos adicionales de tiempo de permanencia.
- Desinfectar la reg....
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Resultados
Las figuras 2-3 muestran los resultados representativos de la distribución de proteoglicanos, la expresión de NF-KB, la rigidez, la viscosidad, la altura del disco, y el peso húmedo para IVDs de ratón en cultivo. Si se cultivan adecuadamente, los parámetros IVD del grupo de control no debe ser significativamente diferente del grupo fresco. Si el cultivo está infectado o comprometido de otro modo, el grupo de control será diferente del grupo fresco, especialmente en la expresión de NF-KB y la distribució.......
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Discusión
Este protocolo describe un cultivo de órganos de la murino FSU con énfasis en el seguimiento de los cambios biológicos en el IVD. El mantenimiento con éxito de estos cultivos requiere técnicas estériles cuidadosas. En particular, la disección de los pasos 2.1 a 2.6 y la cultura los pasos 3.1 a 3.6 requieren un cuidado especial para asegurar que se mantengan las condiciones estériles, y estos pasos se debe realizar preferiblemente en una sala de procedimiento aislado con un flujo de aire .......
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Divulgaciones
Los autores de este manuscrito declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Washington Centro de Investigación musculoesqueléticos (NIH P30 AR057235), Molecular Imaging Center (NIH P50 CA094056), Mecanobiología Formación Grant (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804, y los NIH K01AR069116. Los autores desean agradecer a Patrick Wong por sus contribuciones en la recolección de datos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de 96 pocillos | Midwest Scientific TP92096 | Se utiliza para ensayos bioquímicos | |
| Placa de 24 pocillos | Midwest Scientific TP92024 | Se utiliza para el cultivo de órganos | |
| Pipetas de 25 ml | Midwest Scientific TP94024 | Se utiliza para el cultivo de órganos | |
| Pipetas de 10 mL Midwest | Scientific TP94010 | Se utiliza para el cultivo de órganos | |
| Pipetas de | 5 mlMidwest Scientific TP94005 | Se utiliza para el cultivo | |
| de órganos, filtros de tapa de botella de 500 ml, 22 y micro; m | Midwest Scientific TP99505 | Se utiliza para medios filtrantes | |
| 10 y micro; Puntas de pipeta L | Midwest Scientific NP89140098 | Se utiliza para ensayos bioquímicos | |
| 200 & Puntas de pipeta L | Midwest Scientific NP89140900 | Se utiliza para ensayos bioquímicos | |
| 1.000 y micro; Puntas de pipeta L | Midwest Scientific NP89140920 | Se utilizan para ensayos bioquímicos | |
| DMEM/F-12 | Invitrogen | 11330032 Se utilizan para medios de cultivo | |
| Optiray 350 | Guebert | 19133341 | Se utilizan para microCT |
| con contraste Suero fetal bovino | Sigma | F2442 | Se utiliza para medios de cultivo |
| Penicilina Estreptomicina | Sigma | P4333 | Utilizado para medios |
| de cultivo Cloruro de azul de tetrazolio | Sigma | T4375 | Utilizado para ensayos bioquímicos |
| D-Luciferina | Sigma | L6152 | Utilizado para imágenes de bioluminiscencia |
| Sulfato de condroitina | Sigma | C9819 | Utilizado para ensayos bioquímicos |
| Solución de ácido fosfomolíbdico al 10% | Sigma | HT152 | Utilizado para contraste |
| microCT mejorada Safranina O | Sigma | S8884 | diluida a una concentración de .1% (en agua) |
| Fast Green FCF | Sigma | F7258.001 | % |
| concentración Papaína de látex de papaya | Sigma | P3125 | Utilizado para ensayos bioquímicos |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Tinción de ácido nucleico |
| Pegamento de cianoacrilato | Loctite | 234790 | Adhesivo |
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL Fischer | Scientific | S348903 | Se utiliza para ensayos bioquímicos |
| Equipos grandes | |||
| BioDent | ActiveLife | Para pruebas mecánicas | |
| Cytation 5 | Biotek | Espectrofotómetro | |
| AxioCam503 | Carl Zeiss AG | Microscopio | |
| VivaCT40 | Scanco | MicroCT | |
| Balanza analítica | Denver Instrument Company | A-200DS | Balanza analítica |
| Incubadora HERAcell 150i | Thermo Scientific | Cultivo de órganos | |
| Visor de disección | VistaVision | Utilizado durante la disección | |
| Micrómetro láser | Keyence | LK-081 | Altura |
| Microcentrífuga 5810 R | Eppendorf | Se utiliza para ensayos bioquímicos | |
| Microtomo | Leica | RM2255 | Utilizado para histología |
| Software | |||
| Prism 7 | GraphPad | para estadísticas | |
| MATLAB R2014a | Mathworks | Para el modelado | |
| Osiri-LXIV | Pixmeo | Open Source | |
| MeshLab v1.3.3 | Laboratorio de Computación Visual - ISTI - CNR | Open Source | |
| Vista previa/FEBio 2.3 | Utah MRL & Columbia MBL | Open Source | |
| ImageJ | NIH | ||
| Microsoft Excel | Windows | ||
| Herramientas de disección | |||
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Herramientas de Bellas Ciencias | 15000-02 | O cualquier buen par de tijeras de resorte |
| Tijeras finas - Sharp (pequeño) | Herramientas de Bellas Ciencias | 14060-09 | |
| Tijeras finas - Afiladas (más grande) | Herramientas de Bellas Ciencias | 14060-11 | |
| Dumont #5 Pinzas | Herramientas de Ciencia Fina | 11252-40 | Al menos 2; también puede usar #3 |
| Pinzas Graefe Extra Finas, Herramientas de Ciencias Finas dentadas | 11150-10 | Al menos 2 | |
| Pinzas Micro-Adson, dentadas | World Precision Instruments | 503719-12 | |
| Pinzas Micro-Adson, dientes | 501244 | World Precision Instruments | |
| - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Mango de bisturí - #4 | Herramientas de ciencia fina | 10004-13 | |
| Hojas de bisturí - #23 | Herramientas de ciencia fina | 10023-00 | |
| Alfileres para insectos, tamaño 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Aguja de 27 G | Agujas BD PrecisionGlide BD305109 |
Referencias
- Dagenais, S., Caro, J., Haldeman, S. A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally. Spine J. 8 (1), 8-20 (2008).
- Urban, J., Roberts, S. Degeneration of the intervertbral disc. Arthritis Res Ther. 5
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Reimpresiones y permisos
