التحقيق في الاتجار بالغشاء أمر بالغ الأهمية لفهم وظائف الخلايا العصبية. هنا، ونحن نقدم طريقة لقياس الحركة الحويصلة في الخلايا العصبية. هذا هو وسيلة مريحة التي يمكن أن تتكيف مع القياس الكمي للاتجار الغشاء في الجهاز العصبي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
كمي من إندوسوم و ليسوسوم التحركات في الخلايا العصبية المستزرعة باستخدام تحقيقات الفلورسنت
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في الدماغ، نظم الاتجار غشاء تلعب أدوارا هامة في تنظيم وظائف الخلايا العصبية، مثل التشكل العصبية، اللدونة متشابك، والبقاء على قيد الحياة، والاتصالات الدبقية. حتى الآن، وقد ذكرت العديد من الدراسات أن عيوب في هذه النظم تسبب مختلف الأمراض العصبية. وهكذا، فهم الآليات الكامنة وراء ديناميات الحويصلة قد توفر أدلة مؤثرة التي يمكن أن تساعد في علاج العديد من الاضطرابات العصبية. هنا، نحن تصف طريقة لقياس الحركات الحويصلات، مثل المسافة الحركة ومعدل الحركة، وذلك باستخدام برنامج المكونات في لمنصة إيماجيج. للحصول على صور لتقدير الكميات، وصفنا الهياكل العصبية-ليسوسوم الخلايا العصبية مع إغف الموسومة بروتينات حويصلة علامة ولاحظ حركة الحويصلات باستخدام المجهر الفاصل الزمني. هذه الطريقة مفيدة للغاية وتبسيط قياس الحويصلة الحركة في نيوريتس، مثل المحاور العصبية، والتشعبات، وكذلك في سوما من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية على حد سواء. Furthermoإعادة، وهذا الأسلوب يمكن تطبيقها على خطوط الخلايا الأخرى، مثل الخلايا الليفية والخلايا البطانية. ويمكن أن يوفر هذا النهج تقدما قيما لفهمنا للاتجار بالأغشية.
المقدمة
السيطرة الدقيقة على الاتجار إندوسوم-ليسوسوم أمر لا غنى عنه لتنظيم وظيفة الخلايا العصبية. ومن الجدير بالذكر أن الحركات الديناميكية لهذه الحويصلات هي عامل رئيسي في تنظيم التشكل العصبي، والتنمية، والبقاء على قيد الحياة. العيوب في هذا النظام يسبب اضطرابات عصبية شديدة 1 ، 2 . وتعتبر الآليات الجزيئية التي تربط الاتجار بالحويصلة بالأمراض العصبية معقدة، وسعت عدة مجموعات إلى دراسة هذه الأهمية. على سبيل المثال، فقد أفيد أن الحركة المضطربة في نهاية متأخرة يرتبط بشكل كبير مع نيمان بيك C المرض 3 ، وهو اضطراب العصبية الموروثة الناجمة عن عيوب ليسوسوم. مثال آخر ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية بموافقة من لجنة تسوكوبا رعاية الحيوان واستخدامها (إاكوك).
1. تشريح
- لإعداد يوم الجنينية 13-14 إكر أو C57BL / 6 الأجنة، الموت ببطء الفئران الحوامل عن طريق خلع عنق الرحم. إزالة الرحم ووضعه في طبق بتري مع الحل الملح المتوازن هانك (هبس). شطف جيدا لإزالة الدم.
- باستخدام ملقط، ونقل الرحم إلى طبق بتري جديد مع الايثانول 70٪ لتعقيم.
- نقل الرحم إلى طبق....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وقد تم تصميم هذا الفحص لقياس ديناميات الحويصلة في الثقافة في المختبر . وقد استخدم هذا الفحص لتحديد حركة الحويصلة المرتبطة مورفولوجيا الخلايا العصبية والبقاء على قيد الحياة. الشكل 1A والبيانات B عرض ممثل تظهر الحركة ليسوسوم في الخلايا العصبية. تم ترانزفكتد الخلايا العصبية القشرية مع علامة ليسوسوم، لامب-إغف، ولاحظت باستخدام المجهر مضان القياسية. وقد ذكرت سابقا أن الحويصلات إندوسوم-ليسوسوم محددة متحر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هذا البروتوكول يقدم الإجراء لقياس الحركة الحويصلة. في الخلايا العصبية الأولية، إندوسوميس و ليسوسوميس تميل إلى إظهار حركية عالية في الخلايا العصبية الأصغر سنا (4-6 ديف). وبالنظر إلى أن الخلايا العصبية يجب أن تقدم بعض المكونات إلى الحواف الرائدة لاستطالة العمليات العصبية، وينبغي أن يحدث الاتجار الغشائي بشكل حيوي خلال هذه المرحلة. وبالتالي، فمن المهم استخدام الخلايا العصبية الأصغر سنا لمراقبة الحركة الديناميكية في التشعبات العصبية. وبالإضافة إلى ذلك، حويصلات أكبر لا تميل إلى أن تظهر .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
نشكر الدكتور ريكاردو دولميتسش (كلية الطب بجامعة ستانفورد؛ الانتماء الحالي: معاهد نوفارتيس للبحوث الطبية الحيوية) للمساعدة في تطوير هذا التحليل والدكتور ماثيو وود، تاكوما أيهارا، ودونغسوك كيم لقراءتهم النقدية للمخطوطة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الوسط العصبي العصبي | ثيرمو فيشر | 21103-049 | |
| وسط النسر المعدل من دولبكو (DMEM) | واكو | 044-29765 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985070 | متوسط خال من المصل |
| محلول الملح المتوازن هانك (HBSS) | ثيرمو فيشر | 14170112 | |
| بنسيلين ستريبتميسين | ثيرمو | فيشر 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| B-27 مكملات | Thermo Fisher | 17504044 | |
| 2.5٪ تريبسين | ثيرمو فيشر | 15090046 | |
| بولي دي ليسين هيدروبروميد (PDL) | سيجما | P7280 | |
| بولي إل أورنيثين (PLO) | مصفاة | ||
| كورنينج | 431750 | ||
| ليبوفيكتامين 2000 | كاشف الإرسال | الحراري فيشر 11668027 | |
| البولي إيثيلين "ماكس" (PEI) | polysciences | 24765 | كاشف التعداد. كبديل ل Lipofectamine2000 ، يتوفر 0.1 مجم / مل بولي إيثيلين مذاب في ماء معقم. لكنها منخفضة الكفاءة والسمية العالية. |
| BIOREVO BZ-9000 | نظام حضانة كينس | NA | |
| INUG2-K13 | توكاي هيت | NA | |
| GraphPad منشور الإصدار 6.0 | برنامج GraphPad | NA | |
| الإصدار 15 | Microsoft | NA | |
| ImageJ verion 1.47 | NA |
المراجع
- Nicot, A. S., Laporte, J. Endosomal phosphoinositides and human diseases. Traffic. 9 (8), 1240-1249 (2008).
- De Matteis, M. A., Luini, A. Mendelian disorders of membrane trafficking. N Engl J Med. 365 (10), 927-938 (2011).
- Lebrand, C.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
