스펙트럼 유동 세포 계측법에 의해 고체 조직에서 분리 한 세포 현탁액의 분석

Sandrine Schmutz; Mariana Valente; Ana Cumano; Sophie Novault

doi:10.3791/55578

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방법 논문

스펙트럼 유동 세포 계측법에 의해 고체 조직에서 분리 한 세포 현탁액의 분석

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DOI:

10.3791/55578

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2017년 5월 5일

Sandrine Schmutz¹ , Mariana Valente²^,³^,⁴^,⁵ , Ana Cumano² , Sophie Novault¹

¹Flow Cytometry Core Facility, Center for Translational Research-Technical Core, Institut Pasteur, ²Unit for Lymphopoiesis, Immunology Department, INSERM U1223, University Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Institut Pasteur, ³Stem-Cell Microenvironments in Repair/Regeneration Team, Instituto de Investigação e Inovação em Saúde (i3s), INEB - Instituto de Engenharia Biomédica, ⁴ICBAS - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto, ⁵Stem Cells and Regenerative Medicine Team, UMRS 1166, ICAN - Institute of Cardiometabolism And Nutrition, UPMC - Université Pierre et Marie Curie - Paris 6, INSERM

이 논문에서

요약

이 문서 분광 계측법, 형광 색소를 구별하는 발광 스펙트럼의 형상을 사용하여 유동 세포 계측법에서의 새로운 접근 방식을 설명한다. 알고리즘은 보상을 대체하고 독립적 인 매개 변수로 자동 형광을 처리 할 수 있습니다. 이 새로운 접근 방식은 고체 기관에서 분리 된 세포의 적절한 분석을 할 수 있습니다.

초록

유동 세포 계측법 정의하고 림프 및 기타 조혈 세포의 표현형을 분석하기 위해 지난 40 년 동안 사용되어왔다. 처음 몇 형광 색소의 분석으로 제한, 현재 다른 형광 염료 수십있다, 최대 14-18 다른 염료는 한 번에 결합 할 수 있습니다. 그러나 다음과 같은 몇 가지 제한 사항이 여전히 분석 기능을 손상. 이 때문에 형광 프로브의 다수의 데이터 분석 인해 대형 멀티 파라미터 보정 행렬들의 필요성 점점 복잡해지고있다. 고형 장기에 의한 자동 형광 세포 현탁액 (유동 세포 계측법에 의하여) 분석이 필요하므로 또한, 검출 및 다른 조직에서 특정 세포 유형을 추적 형광 단백질을 운반하는 돌연변이 마우스 모델은, 가능하게되었다. 연속적인 파장의 넓은 범위에 따라 발광 스펙트럼의 형상을 구분하는 유세포 스펙트럼, 이러한 문제를 해결한다. 데이터는 분석 승보상 행렬을 대체하고 독립적 인 매개 변수로 자동 형광을 처리하는 알고리즘 i 번째. 따라서, 스펙트럼 유세포 유사한 발광 피크와 형광 색소를 판별 할 수 있어야 보상 요구없이 다중 파라미터 분석을 제공 할 수있다.

이 프로토콜은 작은 모집단 검출 높은 해상도를 제공하는 파라미터 (21) (19 형광 프로브) 특성 및 자동 형광 신호의 관리를 허용 계측법 분석 스펙트럼의 흐름을 설명한다. 여기에 제시된 결과는 스펙트럼 유동 세포 계측법 같은 심장과 소장 등 계측법 종래 흐름 특성화하기 어려운 조직으로부터 세포 집단의 분석에 이점을 제공 보여준다. 유동 세포 계측법에 따라서 보상 없이도 계측법 종래 플로우를 실행 가능하고 높은 자동 형광 관리의 다중 파라미터 분석 능력을 보여주는 스펙트럼.

서론

지난 수십 년에서 유동 세포 계측법 (FCM)은 세포 표현형 연구에 필수적인 널리 사용되는 분석 방법이되었다. 특히 바이올렛 레이저 (405 ㎚) (예를 들어, 브릴리언트 바이올렛 새로운 Q 점 염료)에 의해 여기 된 형광 색소 가능한 형광 염료의 실질적인 증가가 있었다. 그러나 가능한 형광 염료의 성장은 중복 배출의 위험을 증가시키고 노동 집약적 보상 행렬을 필요로한다. FCM 고형 조직에서 세포 현탁액을 분석하기 위해 널리 사용되었지만, 자동 - 형광 세포의 존재는 특히 표지 집단의 차별을 제한한다.

스펙트럼 FCM의 기본 원리는 타무라 등에 상세히보고되어있다. ^{^{^1,2.}} 간략하게, 여기서 사용되는 스펙트럼 FCM은 (재료의 테이블 참조) 405, 488, 및 638 nm의 레이저를 구비한다. 스펙트럼 FCM 모든 출사 F 캡처800 내지 500 nm이고, 종래의 대역 통과 필터를 교체 420 nm의 각각 내지 469 nm 내지 440 450 2 개 독립의 PMT에 대한 32 채널 선형 어레이 PMT (32 채널의 PMT)의 스펙트럼과 같은 luorescence. 405 nm 내지 638 nm의 레이저....