Method Article

طرق لتصنيف البؤر السيتوبلازمية كما حبيبات الإجهاد الثدييات

DOI:

10.3791/55656

⸱

May 12th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Rheumatology, Immunology, and Allergy, Brigham and Women's Hospital, 2Department of Medicine, Harvard Medical School, 3Department of Histology and Embryology, Poznan University of Medical Sciences, 4The Broad Institute of Harvard and M.I.T.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حبيبات الإجهاد (سغس) هي الهياكل السيتوبلازمية غير الغشائية التي تشكل في الخلايا المعرضة لمجموعة متنوعة من الضغوط. سغس تحتوي على مرناس، والبروتينات ملزم رنا، الوحدات الفرعية الريباسي الصغيرة، العوامل المرتبطة الترجمة، والبروتينات خلية إشارة مختلفة. يصف هذا البروتوكول سير العمل الذي يستخدم العديد من النهج التجريبية للكشف عن، وتحديد، وتحديد الكميات سغس حسن النية .

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وغالبا ما تتحدى الخلايا التغيرات البيئية المفاجئة. حبيبات الإجهاد (سغس)، المجمعات ريبونوكلوبروتين السيتوبلازمية التي تشكل في الخلايا المعرضة لظروف الإجهاد، متورطة في جوانب مختلفة من استقلاب الخلية والبقاء على قيد الحياة. تقوم سغس بتعديل مسارات الإشارات الخلوية، التعبير الجيني بعد النسخي، وبرامج الاستجابة للإجهاد. تشكيل هذه الحبيبات التي تحتوي على مرنا يرتبط مباشرة إلى الترجمة الخلوية. يتم تشغيل الجمعية سغ من قبل بدء الترجمة المثبطة، ويتم تشجيع التفكيك سغ عن طريق تفعيل الترجمة أو عن طريق استطالة الترجمة المثبطة. ويبرز تكوين لجنة الدراسات هذه العلاقة. مكونات سغ الأساسية توقفت مجمعات ما قبل البدء في الترجمة، مرنا، والبروتينات ملزمة رنا مختارة (ربس). والغرض من الجمعية سغ هو الحفاظ على الطاقة الخلوية عن طريق عزل مرناس التدبير المنزلي المتوقفة ترانزلاتيونالي، مما يسمح للترجمة المحسنة للبروتينات تستجيب للضغط. في أديتيعلى المكونات الأساسية، مثل المجمعات الترجمة الأولية المتوقفة، سغس تحتوي على عدد كبير من البروتينات الأخرى وجزيئات الإشارة. العيوب في تشكيل سغ يمكن أن يضعف التكيف الخلوي إلى الإجهاد، وبالتالي يمكن أن تعزز موت الخلايا. وقد ربطت سغس والحبيبات التي تحتوي على الحمض النووي الريبي مماثلة لعدد من الأمراض البشرية، بما في ذلك الاضطرابات العصبية والسرطان، مما أدى إلى الاهتمام الأخير في تصنيف وتعريف الأنواع الفرعية الحبيبية الحمض النووي الريبي. يصف هذا البروتوكول فحوصات لتوصيف وتحديد سغس الثدييات.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا توظف العديد من الآليات للرد على الإجهاد. تحدث بعض الردود على مستوى ما بعد النسخي وتشمل تنظيم ترجمة مرنا و / أو الاستقرار 1 ، 2 . يرتبط ترانزلاتد مرنا اعتقال متعدية وتدهور مع تشكيل بؤر الخلوية غير الغشائية محددة، والأكثر تميزا كونها حبيبات الإجهاد (سغس) 3 . سغس هي البؤر السيتوبلازمية التي تركز ترانزلاتس نونترانزلاتينغ في ترانزلاتيونالي-القبض على خلايا الاستجابة للضغط (على سبيل المثال، الأكسدة، صدمة الحرارة، المغاعة المغذية، والعدوى الفيروسية) 4 . بالإضافة إلى مرناس نونترانزلاتينغ، سغس تحتوي على عوامل بدء ال....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الخلية

  1. إضافة كوفرسليبس تعقيمها إلى 12 بئرا من لوحة 24 جيدا، كما هو مبين في الشكل 1A . وهذا يمكن القيام به باستخدام ماصة باستير العقيمة تعلق على فراغ لالتقاط كل ساترة. اضغط بلطف ساترة على جانب البئر للافراج عن شفط، والسماح ساترة الوقوع في البئر.
  2. لوحة 1 × 10 5 U-2 أوس (U2OS) الخلايا العظمية لكل بئر في الحجم النهائي من 500 ميكرولتر من المتوسط. نقل الجانب لوحة إلى الجانب وصعودا وهبوطا عدة مرات للتأكد من أن الخلايا موزعة بالتساوي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البؤر الناجم عن الإجهاد ليست بالضرورة سغس. وتصنف سغس على أنها بؤر السيتوبلازمية التي تحتوي على مرناس، عوامل بدء الترجمة، والبروتينات ملزمة رنا وتكون في حالة توازن مع الترجمة النشطة. يمكن استخدام البروتوكول أعلاه كقالب لتوصيف ما إذا كان الإجهاد معين يدفع سغس حسن النية .

سغس كولوكاليز مع غيرها من علامات سغ المعروفة، بما في ذلك كل من البروتين.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كما يتضح من الدراسات المناعية في أمراض متعددة، والإجهاد المزمن يؤدي إلى تشكيل بؤر الخلايا المختلفة. على سبيل المثال، وتتميز معظم الأمراض العصبية من المجاميع داخل الخلايا من البروتينات غير قابلة للذوبان. وجود البروتينات المرتبطة سغ في مثل هذه المجاميع غالبا ما يكون الأساس لاستنتاج أن هذه البؤر هي سغس. يتم استخلاص استنتاج مماثل أيضا عند ملاحظة سغ بؤر سيتوبلازمية إيجابية في خلايا تعامل مع محفزات الإجهاد الجديدة. يوفر هذا البروتوكول سير عمل بسيط لتحديد سغس حسن النية .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونشكر أعضاء مختبري إيفانوف وأندرسون على مناقشاتهما المفيدة وردود الفعل بشأن هذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة [GM111700 و CA168872 إلى السلطة الفلسطينية، NS094918 إلى بي]، والمركز الوطني للعلوم في بولندا [منحة أومو 2012/06 / M / NZ3 / 00054 إلى وس]. كما تعترف وزارة الصحة والتعليم العالي في بولندا (برنامج موبيليتي بلس) ولجنة فولبرايت البولندية الأمريكية لدعمهم المالي لبحوثه في الولايات المتحدة الأمريكية.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
U-2 OSATCCATCC ® HTB-96 ™الكتابة بشكل شائع "U2OS"
الثقافة عند 37 درجة ؛ C أقل من 5٪ CO2< / sub> في 10٪ FBS / DMEM
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Corning10-013-CVيحتوي على 4.5 جم / لتر من الجلوكوز والبيروفات والفينول الأحمر
مكمل بنسبة 10٪ FBS و 10 ملي مولار HEPES والبنسلين / ستيبتومايسين
مخفف أدوية سابقة
التدفئة مصل الأبقار الجنينية (FBS)SigmaF2442-500mlيستخدم لتكملة الوسائط
HEPES (1 م)ثيرمو فيشر Scientific15630-080يستخدم لتكملة وسائط
البنسيلين ستربتومايسينسيجماP0781-100mlيستخدم لتكملة الوسائط
24 بئر صفيحةكوستار3524
مناديل المختبر (كيمويبيس)KIMTECH SCIENCE34120
غطاء زجاجي لغطاء النمونظارات فيشر Scientific12-545-82تعقيم قبل الاستخدام
الحفاظ على معقمة في غطاء زراعة الأنسجة
الصوديوم (ميتا) زرنيخيت & ge ؛ 90٪ (SA)SigmaS7400-100Gتذوب في الماء بتركيز 1 متر ، ثم تخفف إلى 100 ميكرو ؛ M كمخزون عامل
Vinorelbine (VRB)TSZ CHEMRS055يذوب في الماء إلى 10 ملي مولار
بوروميسينسيجماP9620يستخدم لتقييم مستوى الترجمة (الريبوبوروميسيلأيشن)
- يستخدم لتقييم اتصال SG بالترجمة النشطة
تمييع في الماء إلى 10 مجم / مل
إيميتين ثنائي هيدروكلوريد هيدراتسيجماE2375تستخدم بالاشتراك مع بورومايسين لتقييم مستوى الترجمة العام
تستخدم لتقييم اتصال SG بالترجمة النشطة
- تمييع في الماء إلى 10 مجم / مل
Cycloheximide (CHX)SigmaC4859تستخدم لتقييم اتصال SG بالترجمة النشطة
تمييع في الماء إلى 10 مجم / مل
من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) Lonza/ VWR95042-486مؤقت للغسيل للتألق
المناعيدرجة كاشف بارافورمالدهايد ، بلورية (PFA)SigmaP6148-500Gاصنع محلولا بنسبة 4٪ في PBS الساخن في غطاء الدخان ، وحرك حتى يذوب
يمكن تخزين Aliquots عند -20 درجة ؛ C لعدة أشهر
خطير ، استخدم التهوية
تخلص من الميثانول في النفايات الخاصة
، ACSBDH / VWRBDH1135-4LPPrechill إلى -20 & deg ؛ C قبل الاستخدام
تخلص من النفايات الخاصة
مصل الحصان العادي (NHS)Thermo Fisher Scientific31874تمييع إلى 5٪ في PBS
أضف أزيد الصوديوم للتخزين عند 4 درجات ؛ C
محلول حجب للإيثانول المناعي
، نقي ، 200 دليل (100٪) ، USP ، KOPTECDecon Labs /VWR 89125-188تمييع إلى 70٪ بالماء
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesFisherbrand12-550-15
ماوس مضاد للجسم المضاد G3BP1 (TT-Y) سانتاكروزsc-81940يخزن في 4 درجات ؛ C
1/100 أرنب مخفف
مضاد للجسم المضاد eIF4G (H-300) سانتاكروزsc-11373تخزين في 4 درجات ؛ C
1/250 تخفيف
الماعز المضادة ل eIF3 & eta; (N-20) الجسم المضادسانتا كروزsc-16377eIF3 & eta ؛ يعرف أيضا باسم eIF3b
Store في 4 درجات ؛ C
1/250 فأر مخفف
مضاد للجسم المضاد للبورومايسين 12D10MilliporeMABE343يخزن في 4 درجات ؛ C
1 / 1,000 تخفيف
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H + L)Jackson Immunoresearch715-225-150إعادة التكوين في الماء لكل مصنع ثم يتم تخزينها في درجة حرارة 4 درجات ؛ C
1/250 التخفيف
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H + L) JacksonImmunoresearch711-165-152إعادة التكوين في الماء حسب الشركة المصنعة ثم يتم تخزينها في 4 درجات ؛ C
1 / 2،500 تخفيف
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H + L)Jackson Immunoresearch705-175-147إعادة التكوين في الماء حسب الشركة المصنعة ثم يتم تخزينها في 4 درجات ؛ C
1/250 تخفيف
Hoechst 33258 محلولSigma94403-1MLاحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية
محلول مخزون 0.5 مجم / مل في dH 20 ، حماية من الضوء
- تخزين في 4 درجات ؛ C
Cy3 StreptavidinJackson Immunoresearch016-160-084إعادة التكوين في الماء لكل مصنع تعليمات S ، ثم تخزينها في 4 درجات ؛ C
1/250 تخفيف
oligo- (dT) 40x< / sub> مسبار بيوتينيل بيوتينيلتقنيات الحمض النووي المتكاملة (IDT)/إعادة التكوين في الماء إلى 100 نانوغرام / مل ، aliquot وتخزينها عند -20 & درجة ؛ C
تمييع في المخزن المؤقت للتهجين 1/50 قبل الاستخدام
صندوق تهجينللطلب //اصنع غرفة رطوبة مع أي صندوق منزلق تخزين عن طريق إضافة ورق مرطب في الجزء السفلي
- قم بتسخين الصندوق مسبقا قبل الاستخدام
20x SSC عازلةThermo fisher AmbionAM9763تمييع إلى 2x SSC باستخدام RNase Free water (معالج DEPC)
يخزن في RT
مخزن الغسيل المؤقت للأسماك
PerfectHybPlus Hybridization BufferSigmaH7033-50mlمخزن مؤقت لحضانة
الشرائحمحلي/مزيج 5 جم من " قابل للذوبان في البارد" بولي (كحول الفينيل) في 20 مل من PBS
تخلط عن طريق الصوتنة ، متبوعا بتقليب O / N في RT
أضف 5 مل من الجلسرين و 0.2 مل من أزيد الصوديوم 20٪ ، ويقلب لمدة 16 ساعة في RT
الطرد المركزي عند 20،000 جم لمدة 20 دقيقة ، وتخلص من سائل اللزج الحبيبات الكبيرة
Aliquot ، تخزين طويل الأجل عند -20 درجة ؛ C ، 1 أسبوع عند 4 درجة ؛ C
Parafilm "M"SigmaP7793-1EA
Poly (كحول الفينيل) كاشفSigmaP-8136-250Gلصنع كاشف فينول
جلسرينسيجماG5516-100MLلصنع كاشف
الصوديومأزيد فيشر ScientificS2002-5Gعامل حافظة لحجب المحلول و vinol
قم بعمل تخفيف بنسبة 20٪ في الماء
مخزن مخصص FISH الصنع فينول

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
  2. Yamasaki, S., Anderson, P. Reprogramming mRNA translation during stress. Curr Opin Cell Biol. 20 (2), 222-226 (2008).
  3. Buchan, J. R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Stress GranulesCytoplasmic FociRNA GranulesImmunofluorescence AssayFluorescence MicroscopyPoly A FISHG3BP1 MarkerTranslation InhibitionMammalian Cell StressRNA Binding Proteins

Related Articles