Флэш-и-Фриз: Роман Техника для захвата мембраны динамика с электронной микроскопии

Summary

Мы разработали новый метод в электронной микроскопии, «флэш-и-сублимационной», что позволяет визуализировать динамику мембран с мс временным разрешением. Эта техника сочетает в себе оптогенетику стимуляции нейронов с замораживанием под высоким давлением. Здесь мы продемонстрируем процедуру и описания протоколов в деталях.

Abstract

Клетки постоянно меняют свою архитектуру мембран и распределение белка, но это чрезвычайно трудно визуализировать эти события при временным и пространственным разрешением порядка мс и нм, соответственно. Мы разработали с временным разрешением метода электронной микроскопии, «флэш-и-Фриз», который вызывает клеточные события с оптогенетикой и визуализирует полученную динамику мембран путем замораживания клеток при определенных временных точках после стимуляции. Чтобы продемонстрировать эту технику, мы выразили channelrhodopsin, светочувствительный катионный канал, в нейронах гиппокампа мыши. Вспышка света стимулирует нейронную активность и индуцирует высвобождение нейромедиаторов из синаптических окончаний путем слияния синаптических везикул. Оптогенетика стимуляции нейронов в сочетании с замораживанием под высоким давлением, чтобы следовать морфологическим изменениям во время синаптической передачи. Используя коммерческий инструмент, мы захватили слияние синаптических везикул и восстановление synaptic пузырек мембраны. Для того, чтобы визуализировать последовательность событий, большие наборы данных были получены и проанализированы вслепую, так как морфологические изменения наблюдались в различных клетках с течением времени. Тем не менее, флэш-и-сублимационный позволяет визуализировать динамику мембран в электронных микрофотографиях с мс временным разрешением.

Introduction

Визуальные мембраны и белки динамики в клетке является ключевым шагом на пути к пониманию клеточной биологии отдельных процессов. события Dynamic торговли людьми могут быть получены с помощью света или флуоресцентной микроскопии. Однако субклеточная контекст практически отсутствует в таких изображениях , поскольку субклеточные структуры не могут быть полностью «нарисованной» с помощью красителей или флуоресцентных зондов и решены пространственно и спектрально ^{1, 2.} С другой стороны, в то время как электронная микроскопия может очертить внутриклеточную архитектуру в мельчайших деталях, он не может захватить клеточную динамику, потому что образцы должны быть исправлены до получения изображения. Таким образом, как правило, не достаточно, чтобы полностью понять клеточной динамики, используя только один модальности изображений.

Для того, чтобы преодолеть ограничения, световой и электронной микроскопии, были разработаны корреляционные методы микроскопии. Корреляционная световой и электронной микроскопии(CLEM) визуализирует динамику внутриклеточной с помощью световой микроскопии и лежащих в основе субклеточных структуры с электронной микроскопией. В CLEM, клетка , занятая в различных процессах, такие как цитокинез и эндоцитоз ^{3, 4, 5, 6,} находятся под напряжением, отображаемый , а затем обработаны для электронной микроскопии. Хотя CLEM отражает некоторые аспекты внутриклеточной динамики, есть четыре фактора, которые ограничивают полезность этого подхода. Во- первых, временное разрешение ограничено , как быстро клетки могут быть иммобилизованы, который обычно занимает с - мин из - за медленной диффузии и реакции фиксаторов ^7. Во- вторых, наблюдается субклеточная архитектура постфактум ^8; Таким образом, динамические морфологические изменения не могут быть получены с помощью этого подхода. В-третьих, флуоресценции и электронные микрофотографии не могут быть точно выровнены за счет ш тканиrinkage вызвано обезвоживанием во время подготовки образца для электронной микроскопии ^{9, 10.} В- четвертых, такие события , как цитокинеза и эндоцитоза не происходят в то же время в каждой ячейке ^{5, 11,} и , таким образом, конкретная ячейка , которая занимается в том случае должны быть определены из большого числа клеток. Этот процесс часто трудоемкий. Таким образом, новый метод необходимо вызывать определенные события в каждой клетке и захватить в результате клеточной динамики от быстрой иммобилизации клеток в определенных временных точках.

В последнее время несколько инструментов, которые были разработаны, чтобы вызвать определенные клеточные динамики с использованием света (оптогенетика). Channelrhodopsin является светочувствительным, неселективный катионом канал изолирован от Chlamydomonas reinhardtii ^{12, 13.} Когда channelrhodopsin выражается в neuronaл мембраны, кратко вспышка света вызывает приток ионов натрия в нейроны и вызывает действие потенциала ^{14, 15.} Потенциал действия затем распространяется в синаптические окончания, где синаптические пузырьки сливаются в течение миллисекунд ^{16, 17, 18} Таким образом, channelrhodopsin индуцирует активность нейронов. Для того, чтобы следовать за динамикой мембраны при синаптических окончаниях, нейроны должны быть иммобилизованы в определенные моменты времени после стимуляции мса точности.

Для того, чтобы захватить динамику мембран после индукции нейронной активности, мы в сочетании световой стимуляции с замораживанием ^{17, 18, 19} высоким давлением. Замораживание высокого давления позволяет почти мгновенную иммобилизации клеток с образованием кристаллов уменьшенного льдом ^20. Кристаллы льда чп разрыва мембраны и нарушают внутриклеточную архитектуру ^21. Изменяя интервалы времени между стимуляцией и замораживанием, оборот мембраны в пределах синаптических окончаний было захвачен после индукции потенциала действия.

Здесь авторы демонстрируют экспериментальные процедуры с использованием фризера на коммерческую основу под высоким давлением, что пары в мс временной контроль световой стимуляции с замораживанием высокого давления. В отличие от других инструментов , которые требуют внешнего устройства для управления светом стимуляции и замораживание, световая стимуляция полностью интегрирована в этой системе , и может быть применен с точностью ¹⁹ мс. Этот процесс включает в себя несколько этапов. 1) гиппокамп мыши нейроны культивируют на сапфировых дисках и инфицировали лентивирусы , несущий вектор экспрессии для channelrhodopsin ^18. 2) Нейроны стимулируются и замораживали при определенных временных точках после стимуляции. 3) остеклованный вода заменительд с органическим растворителем, в то время как липиды и белки являются сшитыми с помощью фиксаторов, чтобы сохранить внутриклеточную архитектуру. 4) Образцы инфильтрация и заливали в эпоксидной смоле. 5) Ультратонкие срезы собирают с использованием ультрамикротома. 6) Тонкие секции отображается на просвечивающем электронном микроскопе. 7) сбор и анализ изображений выполняются вслепую относительно моментов времени или генотипов. Клеточная динамика может быть определена путем реконструкции времяразрешенных изображений ^{17, 18.} Пробоподготовка (шаги 2 - 5 выше) требуется неделя, но последующий анализ изображений требует месяцев до года.

Protocol

Все эксперименты проводились в соответствии с нормами и правилами использования животных Национальными институтами здравоохранения. Протокол был утвержден по уходу и использованию комитета животных (IACUC) в университете Джона Хопкинса школы медицины по.

1. Выделение и культура мыши нейронах гиппокампа

1. Рассеките кору от постнатального дня 0 - день 2 (P0 - 2) мозг ¹⁸ мыши. Изолировать астроциты от кортикальных.
   Примечание: мозг мыши был выделен после декапитации. Астроциты служат в качестве фидерного слоя для нейронов гиппокампа.
2. Обработать кору с 800 мкл 0,05% трипсин-ЭДТА в течение 15 мин при 37 ° С, чтобы диссоциировать астроциты.
3. Культура астроциты в Т-75 колбу с 13 мл среды DMEM , содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 0,2% пенициллин-стрептомицина в течение одной недели при 37 ° С и 5% CO _2.
4. Поместите один кислотно-мыть и стерилизовать 18 мм покровного стекла рег лунку 12-луночного планшета.
5. Кратко мыть два 6 мм углерода покрытием дисков сапфира в 70% этаноле и разместить их на верхней части каждого покровного стекла.
6. Готовят раствор поли-D-лизином (PDL) смешиванием 3 мл 17 нМ уксусной кислоты с 1 мл крысиного хвоста коллагена и 1 мл PDL (1 мг / мл). Применить 200 мкл раствора PDL к сапфировых дисков и покровные стекла в течение 5 мин при комнатной температуре.
7. Удалить решение PDL и сухой воздух. Перед использование стерилизовать пластины, полученные на этапах 1.4 - 1.6 в течение 30 мин под ультрафиолетовым светом.
8. Семенной астроцитов с шага 1.3 в 2 мл DMEM при плотности 5x10 ⁴ клеток / лунке в планшете, полученные с шагом 1,4 - 1,6. Grow их при температуре 37 ° С и 5% СО ₂ в течение одной недели.
9. Добавьте 20 мкл фтор-дезоксиуридина (конечная концентрация: 80 мкМ) в каждую лунку по крайней мере, несколько часов, прежде чем культивировании нейронов.
   Примечание: Фтор-деоксиуридин останавливает астроциты деления.
10. Изменение среды в 1,5 мл нейрональных БАВаль среда (см Таблицы материалов) , содержащий 1% L-аланил-L-глутамин (смотрите таблицу материалов), 2% бессывороточную добавку для нервных клеток (см таблицы материалов), и 0,2% пенициллин-стрептомицин ,
11. Подготовка папаин раствора путем добавления 20 единиц папаина к 5 мл раствора фермента (1,65 мМ цистеин, 1 мМ CaCl ₂ и 0,5 мМ ЭДТА в DMEM). Подкислите раствор путем прохождения СО ₂ газа в течение 20 мин. Фильтр-стерилизовать с использованием фильтра 0,22 мкм.
12. Заготавливают мозг от P0 - 2 мышь ^18. Немедленно передать мозг ледяной Hanks'-сбалансированный солевой раствор (HBSS). Рассекать гиппокамп под стереоскопическим, сохраняя ткань погруженной в HBSS.
13. Поместите два гиппокампа в 1 мл раствора папаина, полученном на стадии 1.11. Инкубировать в течение 1 ч на термосмеситель при 37 ° С и 750 оборотах в минуту.
14. Заменить папаин с 1 мл раствора, содержащего инактивировать2,5 мг ингибитора трипсина и 0,5 мг альбумина на мл DMEM. Инкубировать в течение 5 мин при 37 ° С. Аспирируйте от решения инактивирующего.
15. Добавляют 200 мкл нейронного базальной среды (см Таблицу материалов) в изолированном гиппокампа. Растирают с использованием 200 мкл пипетки, чтобы отделить клетки. Подождите, пока недиссоциированные клетки не оседают на дне. Осторожно удалите среду с клетками из верхней части.
16. Повторите шаг 1,15 3x. Бассейн всех диссоциированные клетки в новой 1,5 мл центрифужной пробирки.
17. Подсчитайте количество клеток с использованием гемоцитометра. Пластинчатые нейроны при плотности 6,5 × 10 ⁴ клеток / лунку на верхней части астроцитов слоя , полученного на этапах 1.1 - 1.10.
18. Infect нейронов с лентивирусами , экспрессирующими channelrhodopsin в DIV 3 (3 г в пробирке) ^18.
19. Выполнение флэш-и-замораживание DIV 14, как описано в пунктах 2.1 - 2.5, ниже.

2. Флэш-анд-Фриз

1. Получение Fixative
   1. Под химической капотом, добавьте следующие вещества в коническую пробирку, чтобы подготовить закрепитель: 2,5 мл глутаральдегида (10% акций в ацетоне), 0,25 г осмия, 0,25 мл воды и 22,25 мл безводного ацетона.
      Примечание: Конечная концентрация каждого компонента должна быть 1% в ацетоне. Глютаральдегид добавляют, чтобы сохранить белковые структуры в процессе сублимационной замещения. ВНИМАНИЕ: Острая токсичность осмия высоко. Воздействие паров может повредить роговицу глаза. Он должен быть обработан только в сертифицированном химическом капоте.
   2. Аликвоты 1 мл фиксаторе в пронумерованных флаконах криогенных (2 мл). Хранить закрепитель замораживали в жидком азоте до использования.
      Примечание: осмий осмия и глутаровый альдегид перекрестно реагируют и выпадают в осадок; Таким образом, при смешивании, аликвоты немедленно, колпачок трубки и погрузить криопробирки в жидком азоте, чтобы заморозить закрепитель. Используйте карандаш, чтобы сосчитать криогенные флаконы, так как ацетон может смыть маркеры.
2. Приготовление физиологического солевого раствора
   1. Сделать физиологический раствор путем смешивания Hepes (10 мМ, рН 7,5), NaCl (140 мМ), KCl (2,4 мМ) и глюкозу (10 мМ).
      Примечание: Эти значения являются конечные концентрации. Крио-протекторы не используются для однослойных культур. Тем не менее, надлежащее крио-защищающее требуется для образцов толщиной более 5 мкм. как правило, рекомендуется использовать 20% BSA. Дрожжи пасты и кишечной палочки OP50 также могут быть использованы в качестве крио-протравителей для личинок мух или C. Элеганс.
   2. Добавить CaCl ₂ при 4 мМ и MgCl ₂ в 1 мМ конечной концентрации.
      Примечание: Концентрации CaCl ₂ и MgCl ₂ варьируются в зависимости от экспериментов. Для того, чтобы обеспечить захват exocytic промежуточных продуктов , 4 мМ кальция используется для этих конкретных экспериментов , чтобы увеличить вероятность высвобождения везикул ^18.
   3. ПроверитьОсмолярность использование осмометра. Убедитесь, что она составляет 300 ± 5 мОсма.
   4. Добавить антагонист рецептора AMPA (NBQX) до конечной концентрации 3 мкМ и антагониста рецептора ГАМК (бикукуллин) до конечной концентрации 30 мкМ.
      Примечание: антагонисты рецепторов нейротрансмиттеров добавляются , чтобы избежать рецидива сетевой активности нейронов следующей стимуляции ^18.
   5. Нагреть физиологический раствор до 37 ° C для использования.
3. Подготовка Специализированной высокого давления Freezer и блок Automated Замораживание Замены
   1. Перед замораживанием высокого давления, охладить автоматизированную сублимационной заместительную блок до -90 ° С при заполнении резервуара с жидким азотом.
   2. Охладить ацетон в небольшой чашке до -90 ° C, поместив его внутри образец камеры.
   3. Заполните жидкий азот Дьюара и Дьюара хранения морозильной камеры высокого давления (см Таблицу материалов) с жидким нитропоколения.
   4. Настройка света протокола стимуляции с помощью сенсорного экрана монитора.
      1. Название программы, нажав кнопку «Изменить» рядом с «Название программы» на светлом окне стимуляции. Еще одно окно выскочит.
      2. Настройка программы, набрав «15000 мс» в «темной фазы», ​​«100 мс» в «период», «10 мс» в «импульса» и «1» в «число периодов» для одного стимула 10 Миз. Замораживание ячейки 90 мс позже (рис 1C).
         Примечание: «Темная фаза» позволяет клеткам восстановиться после воздействия света во время загрузки образца. «Период» определяет частоту стимуляции. Например, если стимул должен быть применен при 20 Гц, этот столбец должен быть установлен на 50 мс. «Пульс» определяет длительность светового раздражителя. И, наконец, «количество периодов» определяет общее количество раздражителей. Для создания стимуляции высокой частоты, см Рисунок 1E.
   5. Для «нет стимуляции» управления, типа «15 с» в «темной фазы», ​​«0 мс» в «период», «1 мс» в «импульса» и «0» в «число периодов» в свете стимуляция окно установки, как описано в шаге 2.3.4.
      Примечание: По умолчанию, «импульс» должно быть не менее 1 мс.
   6. На главном экране, убедитесь, что коробка для световой стимуляции проверяется.
   7. Настройка протокола хранения, нажав кнопку «ОБРАЗЦЫ Storage» на главном экране. Нажмите на кнопку «Редактировать». В следующем окне, используйте «+» или «-», чтобы выбрать «2», чтобы сохранить 2 диска в каждом канале (3 канала в общей сложности). Проверьте «включено хранение LN2.»
4. Пример Загрузка и морозильная в высоком давлении Freezer
   Примечание: Все сборки образца и погрузочные шаги выполняются под стереомикроскопом с диапазоном 7.5-60X увеличения. tweezэр используется на этапах 2.4.1 - 2.4.4, чтобы манипулировать образцы. Эксперименты должны быть выполнены при физиологической температуре.
   1. Поместите один диск сапфир, клеточно-стороной вверх, в скважине черного, средней пластины (рис 1B).
   2. Поместите 100 мкм распорного кольцо над сапфировым диском (Фиг.).
   3. Поместите пустой диск сапфировое над разделительным кольцом (рис 1B) после погружения на одной стороне диска в подогретого физиологического раствора со стадии 2.2. Убедитесь, что воздушные пузырьки не зажаты между двумя сапфировыми дисками.
   4. Поместите другой 100 мкм распорное кольцо и 400 мкм распорное кольцо (Фигура 1В). Удалите лишнюю жидкость с помощью фильтровальной бумаги.
   5. Поместите сборку из стадии 2.4.3 между двумя прозрачными полуцилиндрами (рис 1А). Закройте верхнюю крышку красной, чтобы инициировать процесс замораживания.
      Примечание: Заданный протокол запускается автоматически, как только крышка закрыта, Образец остается в одной и той же ориентации в морозильной камере, и вспышка света наносится из верхней части узла образца. Красная крышка выскакивает обратно автоматически, как только процесс замораживания завершен.
   6. Храните образец в Дьюара для хранения.
      Примечание: После замораживания, образец автоматически упал в дьюар заполненного жидким азотом и хранил там до дальнейшей обработки. Дьюара для хранения имеет три камеры, каждая камера может содержать до 3-х образцов не более. Как правило, два образца заморожены при тех же условиях стимуляции, и морозильная камера высокого давления запрограммирован для хранения как в одной и той же камере.
   7. Повторите шаги 2.4.1 - 2.4.6 для каждого образца.
   8. Перейдите к шагу 2.5, когда все камеры наполнены.
      Примечание: Устройство было установлено для хранения до 6 образцов в дьюара одновременно. Таким образом, после каждого 6 - ^го образца, шаг 2.5 должен быть выполнен. После того, как выгружены, повторите шаги 2.4.1 - 2.4.6,
5. Пример сбора и передачи на Automated Замораживание заместительной Unit
   1. Открыть дверь в Дьюара для хранения, который расположен под столом морозильной камеры высокого давления. Удалите Дьюара для хранения и поместите его по крышке.
   2. Используя руки, удалить образец камеру из Дьюара и передать его в специализированном лотке образца, заполненный жидким азотом. Разблокируйте ручку, чтобы освободить чашу образца.
   3. Удалить прозрачные полуцилиндров из чашки для образцов с помощью пинцета после предварительного охлаждения кончиков пинцета с жидким азотом (~ -196 ° С). Аккуратно перенести середину, черную пластину в небольшую чашку, содержащую жидкий азот.
      Примечание: Кончики пинцета должны быть предварительно охлаждены до температуры жидкого азота. Образец должен находиться под жидким азотом во все времена, чтобы предотвратить образование кристаллов льда.

3. Замораживание Замена в Ауtomated Замораживание-замещение блока

1. С помощью пинцета, предварительно охлажденного (советы при ~ -196 ° C), быстро передавать среднюю пластину с шага 2.5.3 к предварительно охлажденным ацетоном (-90 ° С).
2. Отделить сапфировый диск от средней пластины, осторожно встряхивая или внутреннюю резьбу.
   Примечание: Иногда это может быть трудно отделить сапфировый диск от средней пластины. В такой ситуации, оставьте среднюю пластину в предварительно охлажденном ацетоне (-90 ° С) в течение нескольких минут. Нежное постукивание пинцета также помогает отделить сапфир от средней пластины.
3. Поместите криогенный флакон, содержащий фиксатор (этап 2.1) внутри образец камеры блока замещения. Перенести сапфировый диск в криогенной пузырек и поместите крышку на флаконе.
4. Настройка программы замещения замораживания следующим образом: (I) -90 & deg; С в течение 5 - 30 ч, (II) -90 - -20 ° С в течение 14 ч (5 ° С / ч), (III) от -20 ° C в течение 12 ч, и (IV) -20 ° C - 20 ° C в 4 ч (10 ° С / ч).
   ПРИМЕЧАНИЕ: дюРацион первой ступени при -90 ° C может быть изменен. Общая продолжительность замораживания замещения устанавливается таким образом, что программа заканчивается утром (~ 1,5 г) postexperiment около 8 часов утра, так что могут быть выполнены последующие шаги в дневное время.

4. Проникновение и пластиковое Погружение с эпоксидной смолой

1. После завершения программы, используйте руки в перчатках, чтобы передать криогенные флаконы, содержащие сапфировые диски из образца камеры блока замещения к химическому колпаком.
2. С помощью пипетки, добавьте ацетон (при комнатной температуре) для каждого криогенного флакона и мыть каждый сапфировый диск 4 - 6х за 1 - 2 ч.
3. Необязательно, инкубировать образцов в 0,1% ацетата уранила в течение 1 ч, если дополнительный контраст необходим. Промыть 4 - 6 раз с ацетоном в течение 1 - 2 ч.
   Примечание: ВНИМАНИЕ: Существует риск, связанный с внутренним облучением после ингаляции уранилацетате, что вызывает раздражение верхних дыхательных путей. Высокий уровень воздействия может damagе клетки крови. Работа с уранилацетатом должна быть сделана под вытяжной вентиляцией. Рекомендуется защитная одежда.
4. Приготовьте жидкую среду на основе эпоксидной смолы путем взвешивания 6,2 г глицерина полиглицидилового эфира, 4,4 г бисфенола-A эпоксидной смолы и 12,2 г додеценил янтарного ангидрида (DDSA). Тщательно перемешать и добавить 800 мкл бензилового диметиламина (BDMA) при перемешивании. Де-газ в течение 10 мин.
5. Подготовка 30, 70, и 90% эпоксидной смолы в ацетоне из 100% эпоксидной смолы, полученного на стадии 4.4.
6. Добавьте 30% эпоксидной смолы до криогенных флаконах, содержащих сапфировые диски и инкубировать в течение 2 - 3 ч при комнатной температуре в орбитальном шейкере при 120 оборотах в минуту.
7. Заменить 30% эпоксидной смолы с 70% эпоксидной смолы с помощью пипетки и инкубировать в течение 3 - 4 ч при комнатной температуре в орбитальном шейкере.
8. С помощью пинцета, передавать каждый сапфировый диск, сотовый стороной вверх, к крышке включените капсулы. Добавить 90% эпоксидной смолы с крышкой. Инкубируйте O / N при 4 ° С.
9. На следующий день, сделайте свежую среду на основе эпоксидной смолы, как на стадии 4+0,4.
10. Передача каждого сапфирового диска, ячейка стороной вверх, к крышке включените капсулы. Заполните шапку с свежеприготовленными 100% эпоксидной смолой. Изменение на свежий 100% эпоксидной смолы каждые 2 ч, повторяя трижды.
11. Поместите образцы в печи С 60 ° С в течение 48 ч до полимеризоваться.

5. Монтаж Образцы

1. Поместите образец вверх-вниз на стереомикроскопе, так что сапфировый диск, расположенный в верхней части блока смолы. Удалить тонкий слой эпоксидной смолы сверху от царапин с лезвием бритвы.
2. С помощью лезвия бритвы, вырезать неглубокую линию вдоль края сапфирового диска; эта линия помогает отделить сапфировый диск из эпоксидной смолы на стадии 5.3.
3. Отделить сапфировое диск из эпоксидной смолы путем погружения его в жидкий азот в течение приблизительно 10 с.
   Примечание: Клетки будут оставаться в эпоксидной смоле.
4. После удаления сапфирового диска, использовать рассекает область, чтобы найти область с ячейками (4-10X увеличение). Сокращение вокруг интересующей области (~ 2 х 2 мм) с помощью лезвия бритвы (обоюдоострый). Чтобы сохранить образец в месте, выполнить этот шаг, пока образец, приклеенный к поверхности микроскопа.
5. Установите небольшой кусок пластика (~ 2 х 2 х 5 мм), содержащие клетки с помощью клея, содержащего Этилцианакрилат на цилиндрическом фиктивный блоке, изготовленный из эпоксидной смолы. Инкубируйте блок при 60 ° С в течение 1 ч.

6. Секционирование

1. Используйте ультрамикротом в раздел образца.
   1. Обрежьте поверхность пластиковых встраиваемый образца с стеклянным ножом со скоростью 3 мм / с и толщиной 200 нм / секции. Вырезать 4 - 5 секций от поверхности, где расположены астроциты.
   2. Переключение на алмазного ножа и секции со скоростью 0,8 мм / с и толщиной 40 нм / секции. Cut 20 - 25 секций.
2. Собирают ленты секций на однослотовых медных сеток, покрытых 0,7% поливинилацетата (смТаблица материалов).

7. визуализации С помощью просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ)

1. До TEM визуализации, окрасить сечение с 2,5% ацетата уранила в метаноле в течение 5 мин.
2. Промыть сетки в 15 раз 50% метанола. Затем промыть в сверхчистой воде 15й, с каждой стиркой продолжительностью 30 с.
3. Кратко воздушно-сухая секцию и поместите сетку в держатель образца в ПОМ.
4. Изображение на 93,000X увеличении.
5. Получение изображений.
   Примечание: Визуализация обычно делается слепым к точкам времени или генотипов, и обычно ~ 200 изображений собираются / момент времени.

Анализ 8. Изображение

1. Анализ изображений с помощью программного обеспечения (например, ImageJ) с помощью пользовательского макроса (Watanabe, Davis, и Йоргенсен, неопубликованный).
   Примечание: X / Y координаты записываются из везикул, плазматическая мембрана, активная зона мембраны, и все другие связанные с мембранами органелл в синапсах. Текст филэс , содержащие информацию , экспортируются в другое программное обеспечение (например, Matlab). Данные дополнительно анализируются с помощью пользовательских программ.

Results

Используя методику, описанную выше, мы провели «флэш-и-заморозить» эксперименты в мышиных нейронов гиппокампа, экспрессирующих channelrhodopsin. Эти нейроны были заморожены либо 15 мс или 100 мс после начала светового. Ранее мы показали , что экзоцитоза и эндоцитоза синаптических везикул возникают в синаптических терминалов в 15 мс и 100 мс временных точек, соответственно ^18. Эти события были успешно захвачены в соответствующие моменты времени (рисунок 2), предполагая , что флэш-и-Фриз эксперименты могут быть успешно выполнены на выбранную специализированную морозильной камере высокого давления (см Таблицы материалов).

Рисунок 1. Пример Загрузка и программирование в высоком давлении Freezer. А) Образец загрузка таблица высокого рия морозильник. Средняя пластина, показанная на вставке для структурных деталей, помещают в Клем Холдер для загрузки образца. Один из полуцилиндров помещаются в нижней части таблицы загрузки образца, а другой прикреплен с зажимом к верхней крышке. После того, как образец загружен, средняя пластина выдвигаются вперед к нижней половине цилиндра, а крышка закрыта, чтобы инициировать замораживание. В) Образец сборки. Сапфировый диск, содержащий нейроны помещают в лунку средней пластины, с клеткой-стороной вверх. кольцо А 100 мкм помещают непосредственно над сапфировым диском внутри скважины. Затем пустой диск сапфира, смоченный в физиологическом растворе помещает с раствором стороной вниз. Пузырьки воздуха следует избегать. И, наконец, кольцо 100 мкм и кольцо 400 мкм плотно размещены выше. Любая дополнительная жидкость удаляется с помощью фильтровальной бумаги. C) поперечное сечение вложения капсулы с сапфировым диском , погруженным в эпоксидной смоле. СаппПрокат диск помещается в нижней части капсулы, с клеткой-стороной вверх и покрыты эпоксидной смолой для инфильтрации и вложения. D) Программирование морозильной камеры высокого давления для одного, 10 мса стимула. Образцы замораживают 90 мс после того, как световой импульс. Е) Программирование морозильной камеры высокого давления в течение 10 стимулов при 20 Гц. Образцы замораживают 5 мс после последнего импульса света. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Визуализация экзоцитоза и эндоцитоза в нейронах гиппокампа мыши. Гиппокамп нейроны стимулируются раз и замораживают в указанные моменты времени. Электронные микрофотографии показывают экзоцитоза синаптических везикул А) и сверхбыстрого эндоцитоз Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

«Флэш-и-замораживание» подход визуализирует динамику мембраны путем индукции конкретного клеточного события с оптогенетикой и путем замораживания клеток в определенные моменты времени после стимуляции ^19. В этой демонстрации, мы использовали channelrhodopsin, светочувствительный катионный канал, чтобы стимулировать нейроны и захватили слияние и восстановление синаптических везикул в синаптических окончаниях. В последние годы многие оптогенетика инструменты были разработаны ^{22, 23,} все из которых являются совместимыми с флэш-и замораживанию. Например, оборот органеллы может быть вызван с помощью светоиндуцированной гетеродимеризации криптохрома и CIB1 ^24. Кроме того , липидный состав плазматической мембраны может быть изменен светоиндуцированным транслокации фосфоинозитидного фосфатаза к плазматической мембране ^25. Кроме того, небольшие, светочувствительные соединения, такие как азобензол чАнж конформации в зависимости от освещенности длин волн. Это конформационное изменение может быть использовано для активации лигандов каналов или для изменения липидного состава в мембране ^{26, 27.} Caged соединение также может быть использовано для индукции клеточной активности. Тем не менее, индикатор, используемый в текущей установке не может производить достаточное количество энергии для uncaging; Таким образом, дальнейшие оптимизации системы, скорее всего, это необходимо. Тем не менее, применение этих светло-активируемых инструментов являются гибкими-многими клеточными события могут быть вызваны вспышкой света. «Flash-и замораживание» могут захватить получившуюся динамику мембраны.

Есть два основных ограничения метода «флэш-и-сублимационной». Во-первых, она захватывает «снимки» конкретного события из разных клеток. Другими словами, это не представляется возможным наблюдать за динамикой мембраны в одной камере в течение определенного периода времени. Таким образом, для восстановления любой сотовой связи дажет, необходимо приобретать и анализировать большое количество изображений из каждого образца и в каждый момент времени. Кроме того, в нейронах, еще большее количество изображений , необходимо, так как слияние синаптических везикул только занимает места в 20 - 30% синапсов в нейронах гиппокампа мыши ^{18, 28.} Анализ такого большого набора данных требует огромного количества времени. В дальнейшем, для сбора и анализа изображения должны быть автоматизированы , чтобы сделать подход более эффективным , ^{29, 30.}

Второе ограничение накладывается по характеру техники замораживания высокого давления. Когда клетки замерзают, клеточная вода перестраивает с образованием кристаллов льда , если скорость замораживания ниже 100 К / с ^21. Эти кристаллы льда могут проникать мембраны или концентрат растворенных веществ, чтобы изменить местное осмотическое давление, что приводит к разрыву мембраны. Для того, чтобы избежать кристаллов льда, HIGч Давление (~ 2000 атм) применяется к образцам. Из - за супер-охлаждения эффект, морозильную скорость 100 К / с достаточно , чтобы вода не образуя кристаллы льда , при этом давлении ^21. В теории, образцы толщиной 500 мкм, могут быть заморожены без кристаллов льда, но примерно 200 мкм, скорее всего, практический предел, поскольку кубовидные формы льда имеют тенденцию к образованию в толстой ткани, ставя под угрозу морфологию. При обработке образцов толщины более 5 мкм, использование надлежащего крио-протравитель, таких, как БС, необходимо. Однако БС изменит осмолярность раствора и может повлиять на физиологическую реакцию клеток. Таким образом, обширные контрольные эксперименты необходимы для проверки использования БСА в конкретных системах. Кристаллы льда могут также образовывать после замораживания высокого давления, если образцы случайно извлекают из ванны с жидким азотом. Таким образом, крайне важно, чтобы держать образцы в жидком азоте в любое время и использовать предварительно охлажденные щипцыманипулировать ими.

При планировании экспериментов, следующие три точки должны быть рассмотрены. Во- первых, максимальная интенсивность света (460 нм линия) составляет 5,5 - 8,0 мВт / мм ^2. Независимо от того, достаточно, чтобы вызвать активность этой интенсивности должны быть проверено с живыми клетками на флуоресцентный микроскопе до начала вспышки и ЗАМЕРЗАНИЕ экспериментов. Во-вторых, эксперименты должны быть выполнены при физиологической температуре. Этап морозильной камеры высокого давления нагревают до 37 ° C для экспериментов с мыши нейронов гиппокампа ^31. И, наконец, моменты времени должны быть тщательно подобраны, чтобы уловить динамику мембраны. Первоначальные исследования показали, что эндоцитоз завершается через 100 мс стимуляции. Таким образом, три дополнительных временных точках (15, 30, и 50 мс) были также исследованы , чтобы проследить динамику мембраны ^{17, 18.} Эти моменты времени были необходимы, чтобы визуализировать события мембранныхы во время синаптической передачи. Тем не менее, требование в отношении количества временных точек различны в каждом клеточном случае. Таким образом, несколько моментов времени должны быть выбраны до начала большого сбора набора данных.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Система замораживания и низкотемпературного встраивания для световой и электронной микроскопии -AFS II	Leica
Морозильная камера высокого давления - EM-ICE	Leica		EM ICE - это специализированный морозильник высокого давления, который позволяет точно контролировать световую стимуляцию и замораживание.
Осмометр	Gonotec
Ultramicrotome UC7	Leica
Духовка	Blue M
Лезвие бритвы	Personna
Glutaraldehyde	EMS	16530
Тетраоксид осмия	EMS	RT19132	Toxic, открыт только под сертифицированным химическим колпаком
Ацетон	EMS	RT10016
HEPES	Emdmillipore	391340-250GM
Глюкоза	Sigma	49159-1KG
KCl	Sigma	746436-1KG
NaCl	Sigma	S7653-1KG
CaCl2	Sigma	21115-250ML
MgCl2	J.T.Baker	2444-01
Жидкая эпоксидная смола Eponate 12	Ted Pella	18028
Бисфенол А эпоксидная смола Аральдит 502	Тед Пелла	18028
Додеценилянтарный ангидрид (ДДСА)	Тед Пелла	18028
Бензилдиметиламин (BDMA)	Тед Пелла	18241
Специальная закладная (BEEM) капсула	EMS	70021
Медная сетка	Тед Пелла	1GC12H
Поливинилацетат ( Pioloform F)	Ted Pella	19244
Uranyl ацетат	Polysciences	21447-25
Этилцианоакрилат (Суперклей)	Scotch	170497
Trypsin-EDTA	Themo scientific	25300-120
DMEM (модифицированная орлиная среда Дульбекко)	Thermo scientific	10569-044	Следует нагреть до 37 °°; C перед применением
FBS (Фетальная бычья сыворотка)	Thermo scientific	26140-079
Pen-Strep	Thermo scientific	15140-122
Фтордезоксиуридин (FUDR)	Sigma	F0503
Стеклянная крышка скользящая	Fisher	S175223	Следует промыть кислотой
Сапфировый диск	Technotrade	616-100
Уксусный кислота	Emdmillipore	1000631011
поли-D-лизин (PDL)	Sigma	P6407
Коллаген крысиного хвоста	Thermo scientific	A10483-01
Нейробазал А	Фишера	10888022	Следует подогреть до 37 градусов; C перед применением
L-аланил-L-глютамин (Глутамакс)	Fisher	35050-079
Добавка без сыворотки  (В-27)	Сбалансированный по Фишеру	17504044
Хэнксу солевой раствор (HBSS)	Thermo scientific	24020117
Papain	Worthington	LS003126	Active Unit следует рассчитывать для каждой партии
термомиксера	Eppendorf	Термомиксер C
Ингибитор трипсина	Sigma	T9253
NBQX	Tocris	03-731-0
Bicculine	Tocris	01-091-0
Whatman I фильтровальная бумага	GE
Transmission Электронный микроскоп	Philips CM20