Method Article

マイクロウェルアレイプラットフォーム内での微生物コミュニティ開発の組み立てと追跡

DOI:

10.3791/55701

⸱

June 6th, 2017

 ,  ,  , 
1Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory, 2Bredesen Center for Interdisciplinary Research and Graduate Education, University of Tennessee, 3Center for Nanophase Materials Sciences, Oak Ridge National Laboratory

In This Article

Summary

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微生物群集の発達は、環境構造、メンバーの豊富さ、形質および相互作用を含む複数の要因の組み合わせに依存する。このプロトコルは、ニッチサイズや閉じ込めなどの重要な要素を近似できるフェムトリットルウェルに含まれる数千のコミュニティを同時に追跡するための合成の微細加工環境を記述しています。

Abstract

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微生物群集の発達は、コミュニティメンバーの空間分布および活動を劇的に変えることができる複雑な決定論的および確率論的因子の組み合わせに依存する。我々は、数千の細菌群を並行して迅速にアセンブルおよび追跡するために使用できるマイクロウェルアレイプラットフォームを開発しました。このプロトコルは、プラットフォームの有用性を強調し、プラットフォーム内の配列のアンサンブル内の単純な2メンバーのコミュニティの開発を光学的に監視するための使用方法を説明します。このデモでは、 緑膿菌の 2つの突然変異体を使用しています。これは、タイプVIの分泌病原性を研究するために開発された一連の突然変異体の一部です。 mCherryまたはGFP遺伝子のいずれかの染色体挿入物は、各マイクロウェル内のコミュニティメンバーの存在および位置をモニターするために使用され得る異なる発光波長を有する蛍光タンパク質の構成的発現を促進する。このプロトコルは、アレイのウェルに細菌の混合物を組み立て、時間経過に伴う各メンバー集団の相対的成長を測定するための経時的蛍光イメージングおよび定量的イメージ分析を使用する。マイクロウェルプラットフォームの播種およびアセンブリ、アレイ内の微生物群集の定量分析に必要なイメージング手順、およびすべて説明した微生物種間の相互作用を明らかにするために使用できる方法。

Introduction

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微生物群は、環境の構造や細胞死、分裂、タンパク質濃度、オルガネラ数、突然変異1に関連する確率論的プロセスのような決定論的要因の両方によって形成される。自然環境の中で、これらの影響がコミュニティの構成と活動に与える個々の影響を解析することは、ほとんど不可能です。自然の構造によって隠され、化学的および生物学的環境に埋もれて、コミュニティのメンバーを特定し、自然環境内で時空間分布をさらに解決することは非常に困難です。それにもかかわらず、最近の努力は、地域の機能に関する空間的組織の重要性を強調し、進行中の研究2,3,4でメンバーの豊富さと組織の両方を考慮する必要性を指摘している。

それ（ 例えば、土壌構造、植物の根、海洋粒子、または腸の微絨毛）、酸素の存在または不存在、およびその存在が、病原性種はすべて、微生物群集の組成、構造、および機能に影響を及ぼす5,6,7,8,9,10,11。それにもかかわらず、これらの要因を捕らえることを怠った伝統的な文化の技法が引き続き普及している。コミュニティ構成（ 例えば、共依存種の存在）、物理的付着、シグナル伝達分子濃度、および直接的細胞 - 細胞接触は、微生物共同体を形成するためのすべての重要な因子であり、c予防的培養条件。これらの特性は、バルク液体培養または寒天プレート上で複製することは困難である。しかし、自然環境の主要な物理的および化学的特徴の複製を可能にするマ....

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Protocol

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1.シリコンマイクロウェルアレイ製造

  1. パリレンコーティング
    1. 市販のパリレンコーティングシステムを製造者の仕様および指示（設定：気化器設定点= 160℃;ファーネス設定点= 650℃）に従ってシリコンウェハ上に1-1.5μmのパリレンNの間に堆積させる。
      注：約6gのパリレンNをチャンバーに装填すると、厚さ1〜1.5μmのコーティングが得られる。
  2. フォトリソグラフィー
    1. 接着促進剤、20％ヘキサメチルジシラザン（HMDS）、および80％プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート（PGMEA）（ 表の表を参照）でパリレンNコートウェーハを3000rpmで45秒間スピンコートする。接着促進剤を含む2mLの移送ピペットを満たし、それをウェーハ全体に振りかける。ウェーハを乾燥させる前に約10秒間置いてください。
    2. 2 mLのトランスファーピペットに陽性（ 表の表を参照 ）、ウェーハの中心にフォトレジストを分配します。 3000rpmで45秒間回転させて、厚さ約1.5μmのレジストコーティングを得る。
    3. 115°Cでホットプレート上で1分間サンプルをソフトベークする。
    4. コンタクト・アライナーとフォトマスクを目的のウェル・パターンで使用して、サンプルを紫....

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Results

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ここに提示された実験プラットフォームは、細菌群集のハイスループットおよびハイコンテント研究のために設計されています。このデザインにより、さまざまなサイズのウェルで成長する数千のコミュニティを同時に分析することができます。このマイクロウェルアレイ設計により、初期の播種密度、井戸の大きさ、および化学的環境への最終的なコミュニティ組成の依存性を決定することができる。この作品は、マイクロウェルアレイにおける2人のコミュニティの成長を示し、コミュニティの構成と組織を分析する方法を提示します。

ここで使用されているモデルシステムは、P.aeruginosaのタイプVI分泌を研究するためにMousgousラボで設計されました。このシステムは、GFPまたはmCherry蛍光レポーターのいずれかを含むいくつかの突然変異株から構成されています。この研究では、2つの異なる系統を用いた。第1のものは、GFP標識されたΔretS突然変異体であり、これは構成的yは、VI型分泌に関.......

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Discussion

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この記事では、マイクロウェルアレイデバイスと、細菌のコミュニティ開発のハイスループットと高含量の生細胞イメージングベースの解析を可能にするための実験プロトコルを紹介しました。ここでのデモの焦点は、接触仲介型VI型分泌が地域社会の発展に及ぼす影響を研究することであったが、広範囲の微生物群集と微生物 - 微生物相互作用の研究に柔軟に対応するように設計された。ここでの研究は、構成員の存在および位置の容易な追跡を可能にする蛍光マーカーを恒常的に発現する細菌の使用にのみ焦点を当てている。しかしながら、化学環境を変化させることによって成長または摂動後に個々のウェルから生物材料をサンプリングする機会は、原則として、コミュニティ組成および遺伝子発現を同定するために使用され得る。

各シリコンデバイスは、さまざまなウェルを備えたマイクロウェルを含む数十のアレイで構成されています2倍、3倍、または4倍の直径のピッチで組織され、3＆3.5μmの深さまでエッチングされる。栄養素と二次代謝産物はアガロース蓋を通して自由に拡散することができるため、マイクロウェル間のシグナル伝達や局所栄養素枯渇がどのように地域社.......

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Disclosures

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著者は何も開示することはない。

Acknowledgements

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マイクロウェルアレイは、米国エネルギー省基礎エネルギー科学局のナノフェーズ材料科学センターのユーザー施設部門のセンターで製作され、特性評価されました。この研究の資金援助は、オークリッジ国立研究所所長の研究開発基金を通じて提供された。著者らはまた、これらの研究で使用されたP.緑膿菌株の供給についてJ. Mougous Laboratory（Washington、Seattle、WA）に感謝したい 。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
パリレンNスペシャルティコーティングシステムCAS番号:1633-22-3
パリレンコータースペシャルティコーティングシステムズラボコター2 パリレン蒸着ユニット PDS2010
シリコンウェーハWRS 材料直径100mm、500-550μm厚さ、プライム、10-20抵抗率、N / Phos<100>、
接着促進剤Shin-Etsu MicrosciMicroPrime P20 接着促進剤
ポジティブトーンフォトレジストRohm and Haas Electronics Materials LLC (Dou 所有)Microposit S1818 ポジ フォトレジスト (コード 10018357)
Quintel Contact AlignerNeutronix Quintel CorpNXQ 7500 Mask Aligner
反応性イオンエッチングツールオックスフォード機器プラズマラボ システム 100 反応性イオンエッチング
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マルチモードプレートリーダーパーキン エルマーエンスパイア、2300-0000
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自動ステージPriorProScan III
CCDカメラニコンDS-QiMc
ステージトップ環境制御チャンバーIn Vivo ScientificSTEV ECU-HOC
リン酸緩衝生理食塩水サーモフィッシャーサイエンティフィック14190144
ウルトラピュア アガロースサーモフィッシャー サイエンティフィック16500500
25 x 75 mm No. 1.5 coverslipNexterionハイパフォーマンス#1.5H coverslips
蛍光 リファレンス スライドTed Pella2273
物理スタイラス形状測定機KLA TencorP-6
lab wipesKimberly ClarkKimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155
commercial softwareNikonNIS Elements
Zeiss 710 Confocal MicroscopeZeiss
フィルターキューブニコンニコン FITC (96311), ニコン テキサス レッド (96313)
ズ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhou, J., Deng, Y., et al. Stochasticity, succession, and environmental perturbations in a fluidic ecosystem. Proc Natl Acad Sci. 111, E836-E845 (2014).
  2. Valm, A. M., Welch, J. L. M., et al.

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