Summary
עבודה זו מתארת פרוטוקול המשתמש בגישה המוטמעת ברכיבים לחישוב רגישות לאלרגנים של אבקת דשא, בקרב קבוצה של מטופלים מדרום סין עם נזלת אלרגית ו / או אסטמה.
Abstract
רגישות לאבקת דשא מטילה סיכון עולמי למחלות דרכי הנשימה האלרגיות. למרות המניעה מסתמך על החקירה המקומית של אלרגנים אבקה, נתונים בנושא זה מוגבלים בדרום סין. כל הנתונים הזמינים התקבלו על ידי שאלונים של דיווח עצמי, בדיקות זין בעור, ומבחני IgE הכוללים או ספציפיים באמצעות תמציות גולמיות. מסיבות רבות, שיטות אלה אינן אמינות. תגובה תגובתית לדגי ברמודה, דשא של טימותי, וחומולוס משפשף אלרגנים בקוהורט של חולים מגולדו גואנגג'ואו (העיר הגדולה ביותר בדרום סין ופאתייה), עם דלקת נזלת אלרגית ו / או אסטמה נבדקו באמצעות מנתח אימונו-אוטומטי אוטומטי כמרכיב כלי אבחון לפתרון בעיות (CRD).
בפעם הראשונה, שכיחות גבוהה משמעותית של חיובי הדגימה של ברמודה הדגימה הודגמה אצל הדרוזים הסינים עם נזלת אלרגית ו / או אסטמה. בחולים אלה, שכיחות מתוחכמת של רגישותאל הדשא של טימותי ו - Humulus scandens צוין גם, אשר עשוי לנבוע תגובתיות, כמו שני האחרונים אינם נפוצים באזור. זה נתמך גם על ידי זיהוי של רכיבי אלרגן.
ניתוחים אימונואזיים אוטומטיים לחלוטין עשויים להציע עקביות משביעת רצון בין אזורים, מעבדות ומוסדות ועם הזמן. האוטומטיות של המכשיר עשויה לאפשר זיהוי סטנדרטי שלא היה מתגלה בקלות לפני הופעתו של CRD.
זהו מחקר המשתמש בגישת CRD כדי לחקור רגישות לאלרגנים של אבקת הדשא בדרום סין. זה מוסיף עדויות הנוכחי בספרות. נדרשים מחקרים עתידיים כדי לאמת את הממצאים הללו. עם זאת, למרות CRD הוא כלי שימושי, הממצאים שנעשו עם מנתח אוטומטי אוטומטי immunoassay לא צריך להחליף חקירות מעבדה אחרים, הערכות קליניות, המומחיות לרופא.
Introduction
אבקת הדשא מהווה כמעט 50% מהאלרגיות הקשורות באימונוגלובולין E (IgE), ובגלל אופייה המוטס, מטילה סיכון עולמי למחלות דרכי הנשימה האלרגיות, בייחוד אסטמה ונזלת אלרגית 1 , 2 , 3 , 4 . מניעה נגד אלרגיות אבקת הדשא באזור מסתמכת על מידע על ההפצה המקומית של אלרגנים אבקה. לרוע המזל, הספקטרום של האלרגנים המרגישים משתנה ממקום למקום - תצפית הנקראת בדרך כלל סגוליות אזורית.
בסין, טריטוריה מזרחית-אסיאתית גדולה, סגוליות אזורית של רגישות לאבקת הדשא מסובכת עוד יותר על ידי נתונים מוגבלים הקיימים כיום בחלק הדרומי של המדינה במהלך העשורים האחרונים 5 . מיעוט כזה בנתונים הוביל לקושי להציג את הדשא הכולל אבקה sensiטיציון במדינה גדולה זו 6 . בנוסף, הנתונים המצומצמים ביותר על הדרומי הסיני התקבלו במידה רבה משאלוני דיווח עצמי, בדיקות זין בעור (ולא בדיקות מעבדה), סך מדידות IgE (ולא IgE ספציפיות לאלרגיה), וגילוי sIg לאלרגנים ( ולא למולקולות של אלרגן).
דיווח עצמי של סימפטומים אלרגיים יכול להיות אמין כאשר אלרגנים ספציפיים מודאגים. בדיקות זין עור, אם כי נרחב נגיש, כרוך בשימוש של אלרגנים שאינם סטנדרטיים, תמציות אלרגן, אשר בעצמם עשויים להכיל מרכיבים רגישים אחרים המעוררים את הפרשנות התוצאה. האמינות של בדיקת הזין עור גם מבחינה ביקורתית תלוי מניפולציה מיומן על ידי אלרגיסטים או אחיות מומחה, שימוש היסטמין האחרונות, תאימות המטופל (לפעמים קשה מאוד עבור ילדים צעירים). סך הכל IgE שימושי עבור סינון אלרגיה, אבל לא באופן הגיוני לקבוע thהפוגעות באלרגנים בחולה. יתר על כן, כמעט כל אלרגנים מכילים מספר מולקולות רכיב אלרגן. רגישות למרכיבים העיקריים ( כלומר, d 1 p ו d 2 p מתוך קרדית האבק הבית) עשוי להצביע על "אלרגיה" אמיתית (אלרגיה לאלרגן ספציפי, ולא חיוביות כוזבת עקב תגובות צולבות עם אלרגנים אחרים), אבל רגישות לאלו מסוימים ( כלומר, cross-reactive Der 10, טרופיומיזין) לא יכול להיות 7 .
לפני שהוכנסו אבחונים של רכיבים (CRD), הכשלים המאכזבים האלה גרמו ללימודי אלרגן בסין. CRD מזהה במדויק את מרכיבי האלרגן באמצעות מולקולות אלרגניות רקומביננטיות או מטוהרות, ובכך הופך את המדידה לכמותית וניתנת לאפיון בקלות. בעשורים האחרונים, מחקרים אלרגיה לעתים קרובות מועסקים תמציות גס של אלרגנים כי בהכרח להכיל מספר מרכיבים לא רלוונטיים. רבים של אלה שיתוףMponents הם אינרטי, אבל לפעמים, כמה יכול להוביל תגובות חיוביות confounding. השימוש במולקולות אלרגניות רקומביננטיות או מטוהרות ב CRD יכול לעקוף את זה ולכן לספק דיוק הבדיקה טובה יותר. כאשר מעובדים microarrays, גישה CRD במהירות מסכים או מזהה רגישות למאות מולקולות אלרגן בנושאים בודדים. מחקר מתוכנן היטב ל- CRD על רגישות לאבקת הדשא בדרום סין חסר כעת. באופן אידיאלי, מחקר כזה צריך לכלול אוכלוסייה מקומית של כיסוי גיאוגרפי ניכר, להסביר אבקות דשא שדווחו בדרך כלל בסין, ולטפל בהיבטים הטכניים שהוזכרו לעיל. כדי להגיע לרמה מעשית של הרלוונטיות הקלינית וכדי להקל על גיוס דגימות בסרום, החקירה המוקדמת על רגישות לאבקת עשב כאלרגנים משאיפים יכולה להיות ממוקדת גם בחולים עם הפרעות נשימה אלרגיות, ולא באוכלוסייה הכללית.
עבודה זו מתארת שיטההשתמשו בבדיקת תגובת sIgE בדם לעמק ברמודה, דשא טימותי, וחומולוס scandens בחולים של גואנגג'ואו הגדול (העיר הגדולה ביותר בדרום סין ופאתייה) עם נזלת אלרגית ו / או אסתמה באמצעות הגישה CRD 5 . ממצאים אלה על רגישות לאבקת הדשא הסובטרופית והמתונה בדרום סין מוסיפים ראיות חשובות לאלה הקיימים כיום בספרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול המחקר, כולל שימוש מדגם אנושי בסרום, אושר על ידי ועדת האתיקה, בית החולים המשויך הראשון של אוניברסיטת גואנגזו רפואי. כל המשתתפים הציעו הסכמה מדעת בכתב, באופן עצמאי או באמצעות הוריהם (במקרה של ילדים). הפרוטוקול נרשם באופן מקוון (סינית הרישום הקליני משפט, רג לא: ChiCTR-DCC-13004003, עיין http://www.chictr.org/cn/).
1. זיהוי אוכלוסיית המחקר
הערה: מאגר המידע לאלרגיה של מעבדה מרכזית למחלות נשימתיות (AIR-SKLRD) הוא המקור העיקרי לגיוס חולים, משום ש- AIR הוא מאגר הנתונים הגדול ביותר המתועד היטב של מטופלים לבדיקות אלרגנים בדרום סין 9 , 10 . AIR כבר אחסון דגימות בסרום של חולים במשך כמעט עשור. בקצרה, אלה דגימות מאוחסנים הוכנו בעבר על ידי centrifuging 5 מ"ל oדם phesbotomized ורידי במשך 10 דקות ב 3000 xg ו מחלים supernatant. דגימות בסרום הוכנסו -80 מעלות צלזיוס מקררים לאחסון לטווח ארוך. דוגמאות שעמדו בקריטריונים להכללת המטופלים היו מוכנות לשימוש עבור כל הבדיקות במחקר הנוכחי.
- מתוך מאגר הנתונים AIR, לאחזר נתונים על חולים עם נזלת אלרגית ו / או אסטמה שעברו בדיקות בסרום עבור serge אלרגן דשא בין ינואר 2013 ליוני 2015, תקופת המחקר תוכנן מראש.
- בחרו בחולים עם נזלת אלרגית קלה ו / או אסטמה בהתאם ל - Alergic Rhinitis והשפעתו על אסטמה (ARIA) 11 ואת הנחיות היוזמה הכללית לאסטמה (GINA) 12 . הקצה אותם כ"קבוצת המחקר ".
- לא לכלול חולים עם רישומים רפואיים לא מלאים, אלה שאבדו למעקב, מי מסרבים לתת הסכמה מדעת לגבי השימוש בדגימות שלהם למטרות מדעיות, אלה עם מזוהה אנימינונים, אלה הנמצאים כיום בטיפול אימונוטרפי או בחומרים אימונומודולטוריים, או אלה שנמצאו זיהומים טפיליים.
- בחר קוהורט עכשווי של חולים עם אלרגיות לא-נשימתיות ( כלומר אקזמה, אלרגיות דרמטיטיס ואלרגיה למזון), לפי אותם קריטריונים של אי הכללה והקצה אותם כקבוצת הביקורת.
- ודא כי דגימות בסרום נאספו לפני כל מרשמים או טיפולים ניתנו כדי למזער את ההשפעות המבלבלות על ממצאי המעבדה. לא לכלול מדגם בסרום שאינו עומד בדרישה זו.
- ודא כי כל הנושאים הם תושבי קבע מכל חלקי גואנגג'ואו רבתי ( כלומר, נולד או גר שם במשך יותר מ -10 שנים).
2. מחקר זרימה ומדידות של עניין
- אחזור דגימות בסרום של חולים זכאים מהביו-בנק. כדי לבדוק רכיב אלרגן / אלרגן, להשתמש 140 μL של סרום (כולל 100 μL למלאאת החלל המת).
הערה: נפח הסרום הכולל המרבי הנדרש עבור כל מטופל במחקר זה הוא: 3 אלרגנים ספציפיים ו 8 רכיבי אלרגן, sIgE = 140 μL * 11 = 1,540 μL. - בעת שימוש בכלי זה, בעיקר לבדוק את דגימות בסרום עבור sIgEs לאלרגנים שלמים של הדשא ברמודה, דשא טימותי, ואת Humulus scandens . בצע את ההוראות בסעיף 3.
הערה: אבקות אלה נבחרו עבור המדידות כי ברמודה הדשא 13 , 14 , 15 ו Humulus scandens 16 כבר דיווחו נרחב בסין, בעוד טימותי הדשא 17 , 18 , 19 הוא מין צמח טיפוסי שחי בסביבות החל טרופי כדי ממוזג אזורי הוא למד ביותר בעולם. - שנית, לבדוק את דגימות בסרום מזוהה בשלב 2.3 ישאלרגנים שלמים אל נוכחותם של מרכיבים לאלרגנים של ברמודה [Cyn d 1 (g216)], Timothy [Phlp 1 (g205), Phl p 4 (g208), Phl p 5 (g215), Phl p 6 (g209 ), Phl p 7 (g210), Phl p 11 (g211), ו- pl p 12 (g212)], ודטרמינציות פחמימות חוצות-תגובתי [CCD (o214)]. בצע את ההוראות בסעיף 3.
3. נוהל בדיקה אוטומטי לחלוטין באמצעות מערכת ניתוח Immunoassay
הערה: ההליך כולו של בדיקות אלרגן sIgE, אשר אוטומטי לחלוטין תוארה במקום אחר 7 , 8 , 9 , 10 , בעקבות פרוטוקול של היצרן.
- הפעל את אוטומטי לחלוטין immunoassay Analyzer ( למשל, ImmunoCAP1000) ולהשתמש בו כדי לבצע את immunoassay לאורך כל המחקר. הפעל את המחשב המובנה לניהול מידע (IDM).
הערה: אנאלי immunoassayYzer הוא באופן קבוע במצב המתנה. - עם "כוח ראשוני" ב, להפעיל את "מערכת Power" ולחכות 3 דקות עד מובנית התוכנה מתחילה. לחץ על "טען שטיפה פתרון" ו "טען כביסה פתרון."
- הוסף 140 μL של סרום בקבוקון עבור כל רכיב אלרגן / אלרגן הבדיקה. תווית כל בקבוקון המכיל 140 μL של נסיוב עם מספר זיהוי ייחודי לכל חולה.
- מממשק ה- IDM, בצע את השלבים הבאים על-ידי לחיצה על התפריט.
- בדוק את "רשימת רשימת" חלון על IDM כדי לוודא כי "sIgE" היא שיטת הבדיקה של בחירה.
- טען את צינורות מדגם לתוך המדפים מדגם ואת בקרת איכות צינורות לתוך המדפים בקרת איכות, עם ברקודים.
הערה: עבור כל מטופל, הבדיקה תוכננה תחילה עבור sIgE ל -3 אלרגנים ספציפיים ו -8 רכיבי אלרגן, או 346 * 11 (3,806) צינורות מדגם. עבור כל צינור מדגם, 3 צינורות בקרת איכותהמכילים רמות נמוכות, בינוניות וגבוהות של בקרת sIgE (ראה טבלת חומרים לפרטים) תואמו. בסופו של דבר, רק 58 חולים שנבדקו במבחן הראשוני (שלב 2.3) נבדקו עוד יותר במבחן המשני (שלב 2.3). טעינה של צינורות ניתן להגדיר באופן אוטומטי על קונסולת המחשב. - בחר "טען ריאגנטים" במסך "עיבוד Assay". השלם את הטעינה של המדגם ואת איכות מדפים, פתרון פיתוח, מצומד, כיילים, מוביל, טיפים פיפטה, פתרון להפסיק, פתרון כביסה על פי "Loadlist" (ראה טבלה של חומרים לפרטים).
- ב "טען ולהתחיל," לחץ על "אישור".
הערה: בתום המדידה, התוצאות מופיעות ב - IDM. - בממשק ה- IDM, בחר את הנתונים שייוצאו. לחץ על "תפריט", "אישור", ו "שמירה בשם" ולייצא את תוצאות המדידה sIgE כקובץ גיליון אלקטרוני. ייבא את קובץ הגיליון האלקטרוני לתוכנה סטטיסטית ( לדוגמה, SPSS) 10 . באמצעות מודול ספציפי למקדמי Spearman מתפריט SPSS, לנתח את המתאמים ברגישות בין אבקות הדשא האלה (sije חיובי לאלרגן שלם) לבין רכיבי אבקה (sije חיובי למולקולות האלרגן).
4. הגדרת תגובת sIgE
הערה: עבור הדגימה בסרום שלא נבדקה, טווח המדידה IgE הספציפי הוא 0.35 עד 100 kU / L.
- לדלל את הדגימות עם ערכי sIgE> 100 KU / L 1: 5 ו assay מחדש. כאשר הערך נשאר גבוה מ -100 kU / L, המשך עם דילולים נוספים עד שהגיע לרמה של נקודת קצה עד 1,000 KU / L.
- בהתבסס על ערך הסף של 0.35 kU / L, שקול רמת sigE העולה על 0.35 kU / L כדי להיות חיובי 5 , 7 , 10 . דרג את התגובה(≥0.70 ו <3.50 kU / L), דרגה 3 (≥ 3.50 ו <17.50 kU / L), דרגה 4 (≥ ≥0,0 ו - <0.70 kU / L) 17.50 ו <50.00 kU / L), מחלקה 5 (50 ≥ 50.00 ו <100.00 KU / L), ואת הכיתה 6 (≥100.00 KU / L).
5. ניתוח סטטיסטי
- לנתח את הנתונים עם תוכנה סטטיסטית ( למשל, SPSS) 10 . דווח על הנתונים הכמותיים כסטייה הממוצעת וסטית התקן, הנתונים האיכותיים כטווח החציוני והטווח הבין - רבעוני (IQR) והנתונים הקטגוריים כשיעור התוצאות החיוביות.
- השתמש במבחן צ'י מרובע להשוואה בין קבוצות של פרופורציות, בדיקת t לא מסודרת לנתונים כמותיים, ובדיקת סכום כולל של נתונים איכותיים.
- השתמש במבחן Pearson לניתוח המיתאם בין נתונים פרמטריים, כאשר מקדמי המתאם מתבטאים כ - r, ובדיקת Spearman לערכים לא פרמטריים, עם tמקדמי המתאם מתבטאים כ " r . S ". שקול משמעות סטטיסטית להיות כאשר P- Values <0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מנתח החיסון האוטומטי לחלוטין המשמש במחקר זה יש מבנה שלב מוצק מכוסה באלרגנים צימוד קוולנטיים או אלרגן רכיבים המגיבים עם מולקולות של עניין (sIgE) בדגימות בסרום מן המטופל. עם תוכנית אוטומטית, Analyzer שוטף את כל IgEs שאינם ספציפיים עם μL 150 של פתרון לשטוף וחוזר על זה 5 פעמים. ואז זה מוסיף אנזים שכותרתו נגד נוגדנים IgE (50 μL) כדי ליצור מורכבת. נוגדן אנטי אייג 'שכותרתו אנזים (נוגדנים) הוא נוגדנים משני כי נקשר IgE ספציפי. נוגדנים נגד אנטי IgE מאוגדים בוטלו על ידי שטיפה עם μL 150 של פתרון כביסה (חזר על עצמו 3 פעמים). מורכבים מאוגדים מטופל עם סוכן המתפתח (50 μL) במשך 9 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הסוכן המתפתח הוא סוכן מעכל אנזים שמנתק את כל הנוגדנים האנטי-IgE. האחרון פולט הקרינה בתנאי אלקליין. התגובה נעצרת עםתוספת של פתרון להפסיק אלקליין. לאחר מכן, המכשיר דוחס את מבנה שלב מוצק לסחוט את eluate ולמדוד את הקרינה של eluate כתוצאה באורך גל של 470 ננומטר. הקרינה הוא מתואם ליניארית לרמה מוחלטת של מולקולות אנליטית עניין eluate. ערך פלואורסצנטי גבוה פירושו יותר sIgE בדגימה בסרום. כדי לפרש את תוצאות הבדיקה, המערכת באופן אוטומטי הופך את התגובות עבור דגימות לריכוזים באמצעות עקומת כיול. נתוני המדידה מועברים בצורה אלקטרונית לתוכנת IDM, המשלבת פונקציות לחישוב התוצאות האנליטיות, חישוב הנתונים הסטטיסטיים ודיווח התוצאות.
בעקבות קריטריוני ההכללה וההדרה, המחקר הנוכחי בדק סרום מ -346 חולים. קבוצת המחקר כללה 78 נבדקים עם נזלת אלרגית בלבד, 92 עם אסתמה בלבד ו -88 נלווים עם אסתמה ונזלת. קבוצת הביקורת כללה 88 מטופלים עם אלרגיות לא-נשימתיות. חולים אלו היו בגילאי 1-87 שנים ו אושרו להיות תושבי קבע מכל חלקי גואנגזו רבתי, אזור היעד של המחקר. כל קבוצות המחקר וקבוצת הביקורת היו דומות במאפיינים דמוגרפיים וחברתיים, כולל מגדר, גיל והיסטוריה משפחתית. מבין החולים בקבוצת המחקר, 22.5% נבדקו בעשב ברמודה, 13.6% לעמק טימותי ו -7.0% ל- Humulus scandens . בקבוצת המחקר, שיעור הרגישות לכל אבקת דשא היה גבוה בהרבה מקבוצת הביקורת ( טבלה 1 ). כל הדשא של ברמודה היו חולים שליליים שליליים גם לעשב טימותי וחומולוס מבזבז . מעניין לציין שחולים עם אלרגית ו / או אסתמה הראו שיעור גבוה יותר של רגישות לעשב ברמודה (n = 58, 22.5%) בהשוואה לאלו עם אלרגיות אחרות (n = 4, 4.5%).
= "Jove_content": keep-together.within-page = "1"> במחקר זה לא היו חולים עם תגובת סיווג 6. בין החולים עם תגובת הדשא של ברמודה - 1 sIgE, הסיכוי של בדיקות חיוביות עבור Cyn d 1, טימותי דשא אלרגנים, Humulus scandens , או CCD היה מתחת ל -30%. לעומת זאת, חולים עם דרגה 4 ברמודה הדשא תגובת sieg היה סיכוי של 67-100% של חיוביות יחד עם Cyn d 1, טימותי דשא אלרגנים, Humulus scandens , או CCD ( איור 1 ). ברמודה הדגימה רמות תגובתיות שליליות הראו קשר מובהק, עם סיכויי חיוביות ל - IgEs אחרים של אבקת דשא ( r = 0.669, P <0.001).
טימותי הדשא רגישות הוערך נוספת על ידי סיג לרכיבים טימותי הדשא. בקרב 35 החולים שטופלו בדם, טיבוטי, מרכיב האלרגן שזיהה לעיתים קרובות היה Phl p 4 (100%, 35/35) ואחריו PH 1(17.1%, 6/35). שלושה חולים כל אחד (3/35, 8.6%) היו חיוביים לכל אחד pl 5, 6, 7, 11, ו -12 ( טבלה 2 ). סרום רמות pl 4 sIgE רמות בקורלציה חזקה עם סך האלמות טימותי הדשא ורמות CCD sIgE ( r s = 0.941 ו 0.928, בהתאמה, P <0.001, טבלה 3 ). 41.4% (24/58) מהחולים החיוביים לדשא ברמודה ו -68.6% (24/35) מהחולים שטופלו בדם עם טימוטי היו חיוביים ל- CCD. ניתוח מתאם הדרגות של Spearman הראה קשר משמעותי ברגישות בין CCD לבין אלרגנים אחרים של דשא ( טבלה 3 ).
איור 1: רגישות משותפת בקרב חולים חיוביים לברמודה דשא סיג.
נתון זה מראה את אחוז החולים עם קבוצות שונות של תגובת sIgE לעשב ברמודה (n = 58)רגישות הנמלה לדשא טימותי, Humulus scandens , CCD, ורכיבי אלרגן דשא אחרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
| שיעור בדיקות חיוביות [% (n / מטופלים)] | |||
| דשא ברמודה | דשא טימותי | הומולוס מבזבז | |
| חולים עם AR ו / או AS | 22.5% (58/258) †† ‡ | 13.6% (35/258) † | 7.0% (18/258) |
| חולים עם AR | 21.8% (17/78) †† | 10.2% (8/78) | 7.7% (6/78) |
| חולים עם AS | 22.8% (21/92)View rates | 14.1% (13/92) † | 5.4% (5/92) |
| חולים עם AR ו AS | 22.7% (20/88) †† | 15.9% (14/88) | 8.0% (7/88) |
| גיל | |||
| <14 שנים או פחות | 18.6% (8/43) | 14.0% (6/43) | 7.0% (3/43) |
| > 4 שנים | 23.3% (50/215) | 13.5% (29/215) | 7.0% (15/215) |
| מִין | |||
| זָכָר | 25.7% (35/136) | 13.9% (19/136) | 7.4% (10/136) |
| נְקֵבָה | 18.8% (23/122) | 13.1% (16/122) | 6.6% (8/122) |
| חולים עם אלרגיה אחרת | 4.5% (4/88) ** | 1.1% (1/88) ** | 0 * |
טבלה 1: מטופלים עם בדיקות חיוביות של SIgE עבור ברמוד גראס, טימותי גראס, ו Humolus scandens מבוסס על ישות מחלה ופרטים דמוגרפיים. שיעור גבוה יותר של חולים עם מחלות נשימה אלרגיות היו חיוביות לעשב ברמודה (χ 2 = 14.35, P <0.001), דשא טימותי (χ 2 = 10.88, P <0.001), ו- Humulus scandens (χ 2 = 5.14, P = 0.02) ) לעומת שאר אלרגיה שולטת ( ** P <0.01, * P <0.05). שיעור החולים עם מבחן דשא חיובי של ברמודה היה גבוה באופן משמעותי מהשיעור עבור טימותי דשא ( ‡; P <0.05) ו- Humulus scandens ( †† P <0.01). שיעור החולים עם מבחן דגימות טימותי חיובי היה גבוה יותר מזה של Humolus scandens ( † P <0.05). חלקם של המבחנים החיוביים לעמק ברמודה, דשא טימותי והומולוס scandens sieg לא השתנו באופן מובהק בין הקבוצות הקטנות והמבוגרים (χ 2 = 0.07, P = 0.79, χ 2 = 0.06, P = 0.80, χ 2 = 0.11, P = 0.74, בהתאמה). שיעור הרגישות לאבקת הדשא לא היה שונה סטטיסטית בין גברים ונשים (χ 2 = 1.338, P = 0.25, χ 2 = 0.063, P = 0.80, χ 2 = 0.38, P = 0.54, בהתאמה). כמו כן, לא נצפו הבדלים משמעותיים בשיעורי הרגישות בין חולי הנגיף ואסטמה (χ 2 = 0.030, P = 0.985; χ 2 P = 0.558; Χ 2 = 0.528, P = 0.768; בהתאמה).
| חולים (%) | עמ '4 | Phl p 1 | עמ '5 | עמ '6 | עמ 'י | עמ '7 | עמ '12 | |
| 28 (80.0%) | + | |||||||
| 4 (11.4%) | + | + | ||||||
| 1 (2.9%) | + | + | + | + | + | + | ||
| 2 (5.7%) | + | + | + D> | + | + | + | + | |
| סה"כ | 35 (100%) | 6 (17.1%) | 3 (8.6%) | 3 (8.6%) | 3 (8.6%) | 3 (8.6%) | 3 (8.6%) | |
| SIgE a (kU / L) | 0.52, 0.06-2.02 | 0.02, 0.01-0.10 | 0.04, 0.03-0.24 | 0.12, 0.03-0.34 | 0.05, 0.02-0.27 | 0.03, 0.02-0.36 | 0.10, 0.04-0.28 |
טבלה 2: טימותי דשא רגישות על פי sIgE חיוביות רמות של טימותי דשא רכיבים (N = 35). +, בדיקות חיוביות; A , רמות sIgE (kU / L) מוצגים כחציון ו- IQR. מתוך 35 החולות החיוביות של טימותי, 80.0% היו רק Phl p חיובי 4, בעוד 11.4% היו חיוביים Phl p 4 או phl 1.
| אלרגן | ברמודה | טימותי | הומולוס מבזבז | CCD |
| ברמודה | - | 0.709 ** | 0.682 ** | 0.565 ** |
| Cyn d 1 | 0.583 ** | 0.787 ** | 0.751 ** | 0.865 ** |
| טימותי | 0.709 ** | - | 0.921 ** | 0.856 ** |
| עמ '4 | 0.645 ** | 0.941 ** | 0.886 * | 0.928 ** |
| Phl p 1 | 0.616 ** | 0.681 ** | 0.712 ** | 0.507 ** |
| עמ '5 | 0.46 | 0.273 | 0.590 * | 0.624 * |
| עמ '6 | 0.445 | 0.306 | 0.583 * | 0.569 |
| עמ '7 | 0.681 * | 0.481 | 0.632 * | 0.531 |
| עמ 'י | 0.589 * | 0.372 | 0.620 * | 0.568 |
| עמ '12 | 0.671 * | 0.411 | 0.565 | 0.446 |
| הומולוס מבזבז | 0.682 ** | 0.921 ** | - | 0.853 ** |
טבלה 3: מקדמי קורלציה † לחיוביות בין CCD לבין אלרגנים של אבקת הדשא. † מוצג כמקדם המתאם r s ; ניתוח המתאם של Spearman בוצע עבור מערך נתונים זה שאינו פרמטרית. * P <0.05, ** P <0.01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניתוחים אימונואזיים אוטומטיים לחלוטין עשויים להציע עקביות משביעת רצון בין אזורים, מעבדות ומוסדות ועם הזמן. הליך אוטומטי זה נמצא באופן משמעותי כדי לתמוך במחקר הספסל ומחקרים קליניים, לאפשר זיהוי סטנדרטי של אלרגנים רבים ו / או אלרגן רכיבים, ולזהות אלרגנים סבירות סביר כי לא היה מתגלה בקלות לפני הופעת CRDs. יתר על כן, הליך הבדיקה כולה ניתן להשלים עם בקרת איכות קפדנית, המאפשר לשיטות תפוקה גבוהה, כנדרש בסקר של אזור גיאוגרפי גדול. למרות הליך הבדיקה מנוהל בעיקר על ידי קונסולת המחשב, כמה בעיות קריטיות יש להביא לתשומת לב. זה חובה כי המכשיר משמש קפדנית תאימות עם הוראות שימוש; כל סטייה עלולה לגרום לשגיאות בדיקה מיותרות, נזק מכני או נפגעים אישיים מקרן לייזר או מתח חשמלי גבוה. תמיד enבטוח כי עקומת כיול נכונה נכונה מאוחסן במערכת, כמו זה מקושר לדיוק של הבדיקה. אחרת, ריכוז sIgE של כיול שצוין צריך להימדד לפני בדיקות דגימה בסרום. לאחר מכן, המערכת יכולה אוטומטית לחשב ולאחסן את עקומת כיול לשימוש עתידי. כמו בטכניקות מעבדה אחרות, חשוב גם לבחון את הבטיחות של מניפולציה בסרום האדם כדי להגן על טכנאים מפני זיהומים כדי למנוע זיהום הסביבה.
לראשונה, באמצעות אנליזה אימונו-אוטומטית מלאה כגישה CRD, מחקר זה הראה שכיחות ניכרת של חיובי הדגימה של ברמודה (22.5%) בחולים עם נזלת אלרגית ו / או אסטמה בגואנגג'ואו שבדרום סין. מכיוון שעצי טימותי וה- Humulus scandens אינם שכיחים, אפילו לא קיימים, בגואנגג'ואו, שיעורי ההיענות של דשא טימותי (13.6%) וחומולוס scandens sIgE (7.0%)ניתן לייחס תגובתיות בין צוללות דשא.
על ידי ניתוח של אלרגנים של אבקת הדשא, נראה בבירור כי כל המטופלים החיוביים ל- IgE בדגימת טימותי היו חיוביים גם לאנטיגן הדגימה של טימותי. 4. מעטים (17.1%) שנבדקו חיוביים ל- Phl p 1, אשר היו שונים באופן מפתיע מהנתונים באירופה, כאשר שיעור הפוזיטיביות ל- Phl p 1 גבוה בהרבה מזה של Phl p 4 18 , 20 , 21 . מאחר ש PHl p 1 הוא המרכיב העיקרי של דשא טימותי, השיעור השולט של pl p 4 חיובי על פני phl p 1 באוכלוסיית המחקר עשוי גם להציע תגובה צולבת סבירה מלבד רגישות "אותנטית", משום ש- p p 4 חולקת דמיון מבני עם CCD ועוד מספר אלרגנים אחרים, כולל עצים, ירקות ופירות טרופיים 19 , 22 , 23, 24 הרלוונטיות הקלינית של תצפית זו יכולה להיות שרוב המטופלים החיוביים לדמות בטימותי במחקר זה לא היו צריכים להמליץ על קבלת טיפול חיסוני של טימותי, המשתמש כיום ב- Phl 25 1.
יש לציין מספר מגבלות של שיטות המחקר והטכניקות. ראשית, מאז עד 3 רצועות כיול שונים ניתן להציב מגש פיפטה / מגיב ב Analyzer immunoassay, על מקסימום, שלוש קבוצות הבדיקה ניתן להפעיל באותו זמן. כאשר נדרש עומס עבודה כבד, כמו בסקר אזורי גדול יותר, זה עדיין לוקח כמות משמעותית של זמן כדי לעבד. שנית, התגובה ההצלבתית עם IgA, IgD, IgM ו- IgG אינה קיימת בריכוזים פיזיולוגיים בעת שימוש במנתח ממחקר זה, ולכן יש צורך בגישות מחקריות אחרות כאשר מדובר בתגובות צולבות עם אימונוגלובולינים אלו. שלישית, למרות התחכום של devicה, הממצאים שנעשו עם מנתח החיסונים האוטומטי לחלוטין אינם אמורים להחליף תחליפי מעבדה אחרים, הערכות קליניות ומומחיות של רופא בעת ביצוע אבחון סופי. רביעית, בשל ההקדמה המאוחרת של אלרגן CRD בסין, מספר מוצרים מסחריים של רכיבי אבקה דשא סובטרופי אינם זמינים או לא אושרו למחקר עד לאחרונה. לכן, שימוש בטכניקה זו כגישה CRD לאלרגנים מסתמך במידה רבה על הזמינות המסחרית של מוצרי המוצר מהיצרן לשימוש ספציפי באזור. באזורים טרופיים וסובטרופיים עם מורכבות בכל מקום של אבקות צמחים, מחקר CRD יכול להיות לא מספיק וקשה בשל היעדר מוצרי אלרגן המתאימים לבדיקות. דילמה כזו עלולה לפגוע מאוד ביעילות של טכניקה זו.
עם זאת, למיטב ידיעתנו, זהו מחקר חלוצי המשתמש בגישת ה- CRDO לבחון רגישות לאלרגנים של אבקת הדשא בדרום סין. מחקרים נוספים יכולים להימשך ברוח זו ולאמת את הממצאים הללו.
עד כה, טכניקות באמצעות Analyzer immunoassay אוטומטי מלא התקבלו כסטנדרט זהב עבור בדיקות מבחנה אלרגן מבחנים 26 , 27 . בהתחשב בנתונים המצומצמים מאוד על רגישות לאלרגנים בתוך שטחו העצום של סין, מחקרים במדגם גדול המשתמשים באימונו-אוטומטי אוטומטי באופן מלא כגישה ל- CRD יכולים למלא את הפערים ולהוסיף לראיות הקיימות בתחום זה. חשוב לציין כי מחקרים כאלה, בדרך כלל רב מרכזיים שיתופי פעולה ארצית, עשוי להצריך את הרשתות של immunoaysays מבוסס על פרוטוקול סטנדרטיזציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים Yueming Su על עזרתו בהכנת הדמות. מחקר זה מומן על ידי קרן גואנגדונג של מדע וטכנולוגיה (פרויקט מס ': 2014A020212352), גואנגזו החינוך הלשכה (1201630044, 1201630393) ואת הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC 81572063, NSFC 81601394).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImmunoCAP 1000 Instrument | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 12-3800-01 | |
| Phadia Information Data Manager Software Package | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 12-3801-11 | |
| Software Package, ImmunoCAP 1000 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 12-3801-12 | |
| g2 (Bermuda grass) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4131-01 | |
| g6 (Timothy grass) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4100-01 | |
| w22 (Japanese Hop) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4452-01 | |
| g216 (nCyn d 1) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4972-01 | |
| g205 (rPhl p 1) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5234-01 | |
| g208 (nPhl p 4) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5288-01 | |
| g215 (rPhl p 5b) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5338-01 | |
| g209 (rPhl p 6) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5289-01 | |
| g210 (rPhl p 7) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5290-01 | |
| g211 (rPhl p 11) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5291-01 | |
| g212 (rPhl p 12) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5292-01 | |
| o214 Cross-reacting carbohydrate determinants (CCDs) |
Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5339-01 | |
| Specific IgE Conjugate 400 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9310-08 | |
| Specific IgE Calibrator Strip | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9459-08 | |
| Specific IgE Curve Control Strip | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9312-08 | |
| Specific IgE Anti-IgE ImmunoCAP | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4417-01 | |
| ImmunoCAP Specific IgE Negative Control | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9445-01 | |
| ImmunoCAP Specific IgE Control L | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9528-01 | |
| ImmunoCAP Specific IgE Control M | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9529-01 | |
| ImmunoCAP Specific IgE Control H | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9530-01 | |
| Development Solution | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9439-08 | |
| Stop Solution | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 34-2271-58 | |
| Washing Solution | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9202-08 | |
| FluoroC | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9264-01 | |
| Maintenance Solution Kit | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9476-01 |
References
- Scadding, G. K. BSACI guidelines for the management of allergic and non-allergic rhinitis. Clin Exp Allergy. 38 (1), 19-42 (2007).
- Pollart, S. M., Reid, M. J., Fling, J. A., Chapman, M. D., Platts-Mills, T. A. Epidemiology of emergency room asthma in northern California: association with IgE antibody to rye grass pollen. J Allergy Clin Immunol. 82 (2), 224-230 (1988).
- Wang, Q. Lower airway inflammation and hyperresponsiveness in non-asthmatic patients with non-allergic rhinitis. J Thorac Dis. 7 (10), 1756-1764 (2015).
- Ma, Y. The link between mold sensitivity and asthma severity in a cohort of northern Chinese patients. J Thorac Dis. 7 (4), 585-590 (2015).
- Luo, W. Major grass pollen allergens and components detected in a southern Chinese cohort of patients with allergic rhinitis and/or asthma. Mol Immunol. 78, 105-112 (2016).
- Zhang, Y., Zhang, L. Prevalence of allergic rhinitis in china. Allergy Asthma Immunol Res. 6 (2), 105-113 (2014).
- Zeng, G., Zheng, P., Luo, W., Huang, H., Wei, N., Sun, B. Longitudinal profiles of serum specific IgE and IgG4 to Dermatophagoides pteronyssinus allergen and its major components during allergen immunotherapy in a cohort of southern Chinese children. Mol Immunol. 74, 1-9 (2016).
- Kleine-Tebbe, J., Matricardi, P. M., Hamilton, R. G. Allergy work-up including component-resolved diagnosis: how to make allergen-specific immunotherapy more specific. Immunol Allergy Clin North Am. 36 (1), 191-203 (2016).
- Sun, B., Zheng, P., Wei, N., Huang, H., Zeng, G. Co-sensitization to silkworm moth (Bombyx mori) and 9 inhalant allergens among allergic patients in Guangzhou, southern China. PLoS One. 9 (5), e94776 (2014).
- Zeng, G. Component-resolved diagnostic study of Dermatophagoides pteronyssinus major allergen molecules in a southern Chinese cohort. J Investig Allergol Clin Immunol. 25 (5), 343-351 (2015).
- Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma (ARIA). Management of Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma Pocket Guide. , Available from: http://www.whiar.org/docs/ARIA_PG_08_View_WM.pdf (2015).
- Global Initiative for Asthma (GINA). Pocket Guide for Asthma Management and Prevention. , Available from: http://ginasthma.org/wp-content/uploads/2016/01/GINA_Pocket_2015.pdf (2015).
- Liu, J., Guo, A., Guo, H. Morphological variation and types of Cynodon dactylon. Acta Prataculture Sinica. 12 (6), 99-104 (2003).
- Zhang, H., Xi, J. Study on the germplasm resource and ecological characteristics of wild carpet grass (Axonopus compressus) in Guangdong. Grassland and Turf. 13 (1), 25-28 (2005).
- Kao, S. H., Su, S. N., Huang, S. W. Sub-proteome analysis of novel IgE-binding proteins from Bermuda grass pollen. Proteomics. 5 (14), 3805-3813 (2005).
- Ouyang, Y. H., Zhang, D. S., Fan, E. Z., Li, Y., Zhang, L. Correlation between symptoms of pollen allergic rhinitis and pollen grain spreading in summer and autumn. Zhonghua Er Bi Yan Hou Tou Jing Waike Zazhi. 47 (8), 623-627 (2012).
- Westritschnig, K. Analysis of the sensitization profile towards allergens in central Africa. Clin Exp Allergy. 33 (1), 22-27 (2003).
- Rossi, R. E., Monasterolo, G., Monasterolo, S. Measurement of IgE antibodies against purified grass-pollen allergens (Phl p 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, and 12) in sera of patients allergic to grass pollen. Allergy. 52 (12), 1180-1185 (2001).
- Zafred, D., Nandy, A., Pump, L., Kahlert, H., Keller, W. Crystal structure and immunologic characterization of the major grass pollen allergen Phl p 4. J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 696-703 (2013).
- Chabre, H. Molecular variability of group 1 and 5grass pollen allergens between Pooideae species: implications for immunotherapy. Clin Exp Allergy. 40 (3), 505-519 (2010).
- Mari, A. Skin test with a timothy grass (Phleum pratense) pollen extract vs.IgE to a timothy extract vs. IgE to rPhl p 1 rPhl p 2, nPhl p 4, rPhl p 5, rPhl p 6, rPhl p 7, rPhl p 11, and rPhl p 12: epidemiological and diagnostic data. Clin Exp Allergy. 33 (1), 43-51 (2003).
- Grote, M., Stumvoll, S., Reichelt, R., Lidholm, J., Rudolf, V. Identification of an allergen related to Phl p 4, a major timothy grass pollen allergen, in pollens, vegetables, and fruits by immunogold electron microscopy. Biol Chem. 383 (9), 1441-1445 (2002).
- Andersson, K., Lidholm, J. Characteristics and immunobiology of grass pollen allergens. Int Arch Allergy Immunol. 130 (2), 87-107 (2003).
- Tripodi, S. Molecular profiles of IgE to Phleum pratense in children with grass pollen allergy: implications for specific immunotherapy. J Allergy Clin Immunol. 129 (3), 834-839 (2012).
- Stumvoll, S., et al. Purification, structural and immunological characterization of a timothy grass (Phleum pratense) pollen allergen Phl p 4, with cross-reactive potential. Biol Chem. 383 (9), 1383-1396 (2002).
- Wood, R. A., Segall, N., Ahlstedt, S., Williams, P. B. Accuracy of IgE antibody laboratory results. Ann Allergy Asthma Immunol. 99 (1), 34-41 (2007).
- Wang, J., Godbold, J. H., Sampson, H. A. Correlation of serum allergy (IgE) tests performed by different assay systems. J Allergy Clin Immunol. 121 (5), 1219-1224 (2008).
