Используя липофильную методику окрашивания перхлоратом 1,1'-диоктадеци-3,3,3 ', 3'-тетраметилиндокарбоцианин (DiI), Ambystoma mexicanum может подвергаться сосудистой перфузии, что позволяет легко визуализировать сосудистую систему.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Перфузия DiI как метод сосудистой визуализации в
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Методы перфузии использовались на протяжении веков для визуализации циркуляции тканей. Axolotl (Ambystoma mexicanum) - это вид саламандры, который стал важной моделью исследований регенерации. Мало что известно о том, как реваскуляризация возникает в контексте регенерации у этих животных. Здесь мы сообщаем простой способ визуализации сосудистой сети в аксолотле посредством перфузии перхлората 1,1'-диоктидаци-3,3,3 ', 3'-тетраметилиндокарбоцианина (DiI). DiI - липофильный карбоцианиновый краситель, который мгновенно встраивается в плазматическую мембрану эндотелиальных клеток. Перфузия осуществляется с использованием перистальтического насоса, так что DiI входит в циркуляцию через аорту. Во время перфузии краситель течет через кровеносные сосуды аксолотля и включается в липидный бислой сосудистых эндотелиальных клеток при контакте. Процедура перфузии занимает приблизительно один час для восьмидюймового аксолотля. Сразу после перфузии wiTh DiI, аксолотль можно визуализировать с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа. DiI излучает свет в красно-оранжевом диапазоне при возбуждении зеленым флуоресцентным фильтром. Эта процедура перфузии DiI может быть использована для визуализации сосудистой структуры аксолотлей или для демонстрации моделей реваскуляризации в регенерирующих тканях.
Введение
Визуализация сосудистой сети играет важную роль в понимании структуры и функции организмов у многих видов. Изучены модели и графические представления об обращении с 16 -го века с Леонардо да Винчи 1 . Используя воски и резиновые формы, ткани были перфузированы для создания трехмерных моделей сосудистой сети, что позволило изучить органогенез и патогенез 1 , 2 . Смолы и воски окрашивались красителями , такими как индийские чернила или карминовые красные, чтобы обеспечить их легкую визуализацию 1 , 2 . Однак....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты с аксолотом проводились в соответствии с Комитетом по уходу за больными и их использованием в Бригаме и Женской больнице (BWH).
1. Настройте эксперимент по перфузии
- Поместите взрослый аксолотль в пластиковый контейнер, заполненный 0,1% раствором трикаина (MS222) в течение 15-20 минут или до полного обезболивания. Убедитесь, что контейнер заполнен достаточным количеством раствора трикаина, так что аксолотль полностью погружен в воду.
Примечание. Все процедуры должны выполняться в соответствии с руководящими принципами ухода за животными. При BWH аксолотль считается полностью анестезированным, когда он не ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
При окрашивании DiI сосудистая сеть аксолота может быть легко визуализирована. Кровеносные сосуды животных, перфузируемые липофильным красителем, сразу видны под флуоресцентным конфокальным микроскопом. Рисунок 1 .1-1.5 представляет собой схематическое представление протокола перфузии. После перфузии с ярко-розовым красителем успешно перфорированный аксолотль будет розовым. Используя зеленый флуоресцентный фильтр на конфокальном микрос.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Визуализация сосудистой сети аксолота может быть успешно достигнута путем перфузии с липофильным карбоцианиновым красителем DiI. В этом исследовании мы описываем новый протокол для перфузии аксолотля с DiI с использованием перистальтического насоса. Мы также показываем последующую визуализацию аксолотской сосудистой сети с использованием флуоресцентного конфокального микроскопа. Этот протокол был адаптирован к протоколу перфузии грызунов DiI, наблюдаемому в Li et al. 7 , однако существен.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Это исследование было поддержано Brigham & Women's Hospital и March of Dimes. Авторы хотели бы поблагодарить всех членов Whited Lab за их поддержку и советы.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Перистальтический насос | Маршалл Научный | RD-RP1 | |
| Excelon Lab & Вакуумная трубка | 436901705 | размер S1A | |
| 27г игла-бабочка | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| 2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Дистиллированная вода | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Глюкоза ThermoFischer | A2494001 | ||
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′- тетраметилиндокарбоцианин перхлорат | Sigma Aldrich | 468495 | |
| этанол (100% об/об.) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Хирургический форцепс | Medline | MDG0748741 | |
| пенополистирола | любая квадратная из пенополистирола с аксолотлем вырезать | ||
| хирургические ножницы | Medline | DYND04025 | |
| Скальпель | Медлайн | MDS15210 | |
| Впитывающая пеленка | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Бумажные | |||
| Стандартная одноразовая переводная пипетка | Fisherbrand | 50216954 | |
| Зажимная подставка | Adafruit | 291 | |
| Этил3-аминобензоат метансульфонат | Sigma Aldrich | E10521 | Трикаин |
| порошок Взрослый аксолотль | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Пластиковые баки | Различные размеры, подходящие для аксолотля | ||
| Параформальдегид | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Аксолотль | |||
| Микроскоп Leica | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Флуоресцентный фильтр | Leica | M205FA/M165FC | |
| MS-222 |
Ссылки
- Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels. Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).
- Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
