Utilizzando una tecnica di colorazione perplata di Di-tetraetilindocarbocyanina perchlorato (DiI) lipofilica, l' Ambystoma mexicanum può essere sottoposta a perfusione vascolare per consentire una facile visualizzazione della vasculatura.
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Articolo metodologico
DiI Perfusion come metodo per la visualizzazione vascolare in
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le tecniche di perfusione sono state utilizzate da secoli per visualizzare la circolazione dei tessuti. Axolotl (Ambystoma mexicanum) è una specie di salamandra che è emersa come un modello essenziale per gli studi di rigenerazione. Poco si sa circa come si verifica la rivascolarizzazione nel contesto della rigenerazione in questi animali. Qui riportiamo un metodo semplice per la visualizzazione della vasculatura in axolotl attraverso la perfusione di 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocyanin perchlorato (DiI). DiI è un colorante lipocilico di carbocyanina che inserisce istantaneamente nella membrana plasmatica delle cellule endoteliali. La perfusione avviene usando una pompa peristaltica in modo che DiI entri nella circolazione attraverso l'aorta. Durante la perfusione, il colorante scorre attraverso i vasi sanguigni dell'assolotl e si incorpora nel bilayer lipidico delle cellule endoteliali vascolari al contatto. La procedura di perfusione dura circa un'ora per un axolotl da otto pollici. Immediatamente dopo la perfusione wiTh DiI, l'axolotl può essere visualizzata con un microscopio fluocentrico confocale. Il DiI emette luce nella gamma rossa-arancione quando viene eccitato con un filtro fluorescente verde. Questa procedura di perfusione DiI può essere usata per visualizzare la struttura vascolare degli assoloti o per dimostrare modelli di rivascolarizzazione nei tessuti rigeneranti.
Introduzione
La visualizzazione della vascolarizzazione svolge un ruolo fondamentale nella comprensione della struttura e della funzione degli organismi in molte specie. A partire dal XVI secolo con Leonardo da Vinci sono stati studiati modelli e rappresentazioni grafiche della circolazione 1 . Utilizzando cere e stampi di gomma, i tessuti sono stati perfusi per creare modelli tridimensionali della vasculatura, che hanno permesso lo studio dell'organogenesis e della patogenesi 1 , 2 . Le resine e le cere sono state colorate con coloranti come India Ink o rosso carminio per consentire....
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Protocollo
Tutta la sperimentazione dell'assolotl è stata eseguita in accordo con il comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali di Brigham e dell'ospedale femminile (BWH).
1. Impostare Esperimento di Perfusion
- Posizionare un axolotl adulto in un contenitore di plastica riempito con soluzione 0,1% di tricina (MS222) per 15-20 min o fino a quando completamente anestetizzato. Assicurarsi che il contenitore sia riempito con sufficiente soluzione di triciclici in modo che l'axolotl sia completamente sommerso.
Nota: Tutte le procedure devono essere eseguite in conformità alle istruzioni istituzionali per la ....
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Risultati
Con la colorazione DiI, la vasculatura dell'assolotl può essere facilmente visualizzata. I vasi sanguigni di animali perfusi con il colorante lipofile sono immediatamente visibili sotto un microscopio confocale fluorescente. La Figura 1 .1-1.5 è una rappresentazione schematica del protocollo di perfusione. Dopo la perfusione con il colorante rosa brillante, un axolotl perfuso perfettamente apparirà rosa. Usando un filtro fluorescen.......
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Discussione
La visualizzazione della vasculatura dell'assolotl può essere ottenuta con perfezionamento con il colorante lipocilico di carbocyanina, DiI. In questo studio descriviamo un nuovo protocollo per la perfusione dell'assolotl con DiI usando una pompa peristaltica. Mostriamo anche la successiva visualizzazione della vasculatura axolotl utilizzando un microscopio confocale fluorescente. Questo protocollo è stato un adattamento del protocollo di perfusione di roditore DiI visto in Li et al. 7.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta dal Brigham & Women's Hospital e dalla Marcia di Dimes. Gli autori vorrebbero ringraziare tutti i membri del Lab Whited per il loro supporto e consulenza.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pompa peristaltica | Marshall Scientific | RD-RP1 | |
| Tubo per perfusione | Excelon Lab & Tubo a vuoto | 436901705 | misura S1A |
| 27g ago a farfalla | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Acqua | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glucosio | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′- tetrametilindobocianina perclorato | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Etanolo (100% vol/vol) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Prugne chirurgiche | Medline | MDG0748741 | |
| polistirene espanso | qualsiasi quadrato in polistirene espanso con un taglio a forma di axolotl | ||
| Forbici chirurgiche | Medline | DYND04025 | |
| Bisturi | Medline | MDS15210 | |
| Sottopiede assorbente | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Asciugamani di carta Pipetta | |||
| di trasferimento monouso standard | Fisherbrand | 50216954 | |
| Supporto a morsetto | Adafruit | 291 | |
| Etile 3-amminobenzoato metansolfonato | Sigma Aldrich | E10521 | Tricaina polvere |
| Adulto axolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Serbatoi | Varie dimensioni appropriate per l'axolotl | ||
| Paraformaldeide | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Axolotl | |||
| Leica Microscopio | Leica Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Filtro fluorescente | Leica | M205FA/M165FC | |
| MS-222 |
Riferimenti
- Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels. Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).
- Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R.
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Ristampe e permessi
