Bir lipofilik 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetrametilindokarbosiyanin perklorat (DiI) boyama tekniği kullanarak, Ambystoma mexicanum vasküler yapının kolay görselleştirilmesini sağlamak için vasküler perfüzyona uğrayabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Vasküler Görselleştirme İçin Bir Yöntem Olarak DiI Perfüzyonu
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Perfüzyon teknikleri dokuların dolaşımını görselleştirmek için yüzyıllar boyunca kullanılmıştır. Axolotl (Ambystoma mexicanum), rejenerasyon çalışmaları için önemli bir model olarak ortaya çıkan bir semender çeşididir. Bu hayvanlarda rejenerasyon bağlamında revaskülarizasyonun nasıl gerçekleştiği hakkında pek az şey bilinmektedir. Burada 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) perfüzyonu ile axolotl vaskülatürün görselleştirilmesi için basit bir metodu sunuyoruz. DiI, endotel hücrelerinin plazma membranına anlık olarak giren bir lipofilik karbosiyanin boyadır. Perfüzyon, periyodik bir pompa kullanılarak gerçekleştirilir; böylece DiI, aort üzerinden dolaşıma girer. Perfüzyon sırasında, boya, aksolot'un kan damarları boyunca akar ve temas üzerine vasküler endotel hücrelerin lipid iki katmanına dahil edilir. Perfüzyon işlemi sekiz inçlik bir aksolot için yaklaşık bir saat sürer. Perfüzyon sonrası hemenDiolotl, konfokal flüoresan mikroskop ile görselleştirilebilir. DiI, yeşil-floresan filtresi ile heyecanlandığında kırmızı-turuncu renkte ışık yayar. Bu DiI perfüzyon prosedürü aksolotların vasküler yapısını görselleştirmek veya rejenere dokularda revaskülarizasyon modelleri göstermek için kullanılabilir.
Giriş
Vaskülatürün görselleştirilmesi, birçok canlıda organizmaların yapı ve işlevlerinin anlaşılmasında hayati bir rol oynamaktadır. 16. yüzyılda Leonardo da Vinci ile başlayan dolaşım modelleri ve grafik gösterimleri incelenmiştir. Balmumları ve kauçuk kalıpları kullanarak dokular, organogenez ve patogenez 1 , 2 çalışmasına izin veren vaskülatürün üç boyutlu modellerini oluşturmak için perfüze edildi. Reçineler ve mumlar Hindistan Mürekkebi veya karmin kırmızısı gibi boyalarla renklendirildi ve 1 , 2 kolay görselleştirmelerine izin verdi. Bununla birlikte....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm axolotl deneyleri Brigham ve Kadın Hastanesi (BWH) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi'ne uygun olarak gerçekleştirildi.
1. Perfüzyon Deneyi oluşturun
- Yetişkin bir aksolotu% 15 tricaine solüsyonu (MS222) ile dolu plastik bir kapta 15-20 dakika boyunca veya tamamen anestezi edilinceye kadar yerleştirin. Kabın, aksolotl tamamen suya batırılmış olacak şekilde yeterli tricaine solüsyonu ile doldurulduğundan emin olun.
Not: Bütün prosedürler, kurumsal hayvan bakım kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmelidir. BWH'de, bir ayak-sıkışması testinde başarısız olduğunda bir aksolot'un tamamen anestezi al....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
DiI boyama ile, aksolotlu damar sistemi kolaylıkla görselleştirilebilir. Lipofilik boya ile perfüze edilen hayvanların kan damarları flüoresan konfokal mikroskop altında hemen görülebilir. Şekil 1..1-1.5 , perfüzyon protokolünün şematik bir temsilidir. Parlak pembe boya ile perfüzyon yapıldıktan sonra, başarılı bir şekilde akıtılmış bir aksolotl pembe görünür. Konfokal mikroskopta yeşil bir fluoresan filtre kullanarak vasküler ağın kır.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Aksolotlun vaskülatürünün görselleştirilmesi lipofilik karbosiyanin boyası DiI ile perfüzyon yoluyla başarıyla başarılabilir. Bu çalışmada, bir peristaltik pompa kullanarak diolotl'in diI ile perfüzyonu için yeni bir protokol açıklanmaktadır. Ayrıca bir floresan konfokal mikroskop kullanarak axolotl damar sisteminin daha sonraki görselleştirmesini gösteririz. Bu protokol, Li ve ark.'ında görülen kemirgen DiI perfüzyon protokolünün bir uyarlamasıydı . 7 , ancak kemirgen i.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu araştırma Brigham & Kadın Hastanesi ve Dimes Mart ayı tarafından desteklendi. Yazarlar, Whited Lab'ın tüm üyelerine, destekleri ve tavsiyeleri için teşekkür etmek istiyorlar.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Peristaltik Pompa | Marshall Bilimsel | RD-RP1 | |
| Perfüzyon tüpü | Excelon Laboratuvarı & Vakum Boru | 436901705 | boyutu S1A |
| 27g kelebek iğne | EXELint Tıbbi Ürünler | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2< / sub>HPO<>4< sub> | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Damıtılmış su | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glikoz | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioktadesil-3,3,3′,3′- tetrametilindokarbosiyanin perklorat | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Etanol (% 100 hacim / hacim) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Cerrahi foreceps ve nbsp; | Medline | MDG0748741 | |
| Polistiren köpük çerçeve | aksolotl şeklinde kesilmiş herhangi bir polistiren köpük karesi | ||
| Cerrahi makas | Medline | DYND04025 | |
| Neşter | Medline | MDS15210 | |
| Emici alt ped | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Kağıt havlu | |||
| Standart tek kullanımlık transfer pipeti | Fisherbrand | 50216954 | |
| Kelepçe standı | Adafruit | 291 | |
| Etil 3-aminobenzoat metansülfonat | Sigma Aldrich | E10521 | Trikain toz |
| Yetişkin aksolotl | |||
| MgSO4< / sub> | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2< / sub> | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3< / sub> | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Plastik tanklar | Aksolotl için uygun değişen boyut | ||
| Paraformaldehit | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Axolotl | |||
| Leica Mikroskop | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Floresan Filtre | Leica | M205FA / M165FC | |
| MS-222 |
Kaynaklar
- Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels. Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).
- Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
