극저온에서 수성 혼합물의 마이크로 - 피코 리터 크기의 액 적의 유리 상 밀도를 결정하기위한 프로토콜이 기술되어있다.
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이 논문에서
요약
초록
우리는 원하는 극저온 단계를 준비하기 위해 수성 혼합물 및 빠른 냉각이 필요한 다른 샘플의 유리 상 극저온 밀도를 결정하는 방법을 시연합니다. 마이크로 리터 대 피코 리터 크기의 드롭은 액체 질소 - 아르곤 (N2-Ar) 혼합물 내로 투영함으로써 냉각된다. 방울의 극저온 단계는 X 선 회절 측정과 관련이있는 시각적 분석을 사용하여 평가됩니다. 액체 N 2 -Ar 혼합물의 밀도는 방울이 중성 부력이 될 때까지 N 2 또는 Ar을 첨가하여 조정한다. 이 혼합물의 밀도 및 따라서 낙하의 밀도는 시험 매스 (test mass) 및 아르키메데스 (Archimedes) 원리를 사용하여 결정된다. 방울 준비, 액체 냉각제 혼합물 위의 가스 관리로 빙결을 최소화하고 저온 혼합물을 규칙적으로 혼합하여 밀도 층화 및 상분리를 방지하고 밀도가 50pL만큼 작은 방울의 <0.5 %까지 정확합니다쉽게 결정될 수있다. 수성 동결 방지제 혼합물에 대한 측정은 동결 방지제 작용에 대한 통찰력을 제공하고, 생물학적 동결 보존에서의 열 수축 정합을 용이하게하는 정량적 데이터를 제공한다.
서론
다양한 단계에서 물과 수성 혼합물의 물리적 성질은 근본적인 관심사이며 생체 내 및 생체 외 시스템의 생체 시스템 이해에 중요합니다. 현재의 저온 생물학 및 생물학적 저온 보존에서, 수성 저온 보호제 혼합물의 유리질 또는 비결 정성 단계는 특히 중요하다. 핵 결정의 핵 형성과 성장은 세포와 조직을 파괴하고 단백질의 변성과 응집을 촉진시켜 용제를 투명하게하는 저온 보존 프로토콜이 점점 대중화되고 있습니다. 생체 분자 결정학에서 생체 분자 사이의 채널에서 용매의 결정화는 결정 격자를 파괴하고 회절 특성을 저하시킵니다. 유리질 제거 (Vitrification)는 급냉, 탈수 및 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 동결 방지용 용질의 첨가를 통해 달성됩니다.알콜 및 염.
유리화는 얼음 결정화 및 성장을 제한하지만 모든 냉각 관련 샘플 손상을 제거하지는 않습니다. 예를 들어, 단백질 결정이 유리화 상태로 냉각 될 때 결정 모세관 현상 (결정 평면 방향 분포의 척도)은 일반적으로 10 내지 100 배 증가하고, 유리화 된 정자 세포 및 난 모세포의 해동 후 생존율은 광범위하게 변한다 .
하나의 손상 메커니즘은 냉각 과정에서 용....
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프로토콜
주의 : 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 적절한 보정 가스 처리 조절기 및 밸브, 승인 된 가스 튜빙을 포함한 압축 가스를 사용할 때는 모든 적절한 안전 관행을 사용하십시오. 액체 한제와 접촉하면 심한 동상과 괴사를 일으킬 수 있습니다. 적절한 개인 보호 장비 (얼굴 가리개, 장갑, 실험용 코트, 긴 바지, 닫힌 발가락 신발)를 사용하십시오.이 모든 것은 액체 질소를 불 투과성으로해야합니다. 서있는 상태를 유지하고 액체 한제를 사용할 때 장치에서 방해받지 않는 출구 경로를 확보하십시오. 압축 가스 및 액체 한제를 사용할 때 질식 위험을인지하고 적절한 보충 공기 (흄 후드 또는 높은 공기 회전율 실)로 통풍이 잘되는 곳에서 작업하십시오.
1. 밀도 측정을위한 수용액의 제조
참고 : 무게는 vol보다 높은 정확도로보다 쉽게 측정되기 때문에용액의 농도는 w / w 단위로 측정됩니다. 모든 밀도와 용융 또는 끓는 온도는 ~ 100kPa의 대기압을 가정합니다. 다음 단계는 35 % w / w 글리세롤 용액의 제조를 설명합니다. 같은 과정을 다른 농도와 용질에 사용할 수 있습니다.
- 관심있는 각각의 용질 유형과 농도에 대해 총 용액 용....
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결과
수성 글리세롤 및 에틸렌 글리콜 대비 동결 방지제 농도에 대한 T = 77 K에서의 밀도 측정은 각각 그림 1A 및 그림 1B에 표시되어 있으며 T = 298 K에서 77 K 사이의 해당 부피 변화가 이전에 결정된 T = 298 K 밀도는 그림 2에 나와있다 . 높은 동결 방지제 농도에서 용액은 유리화 상태로 냉각되면서 수축되고 순수한 물은 팽창합니다. 두 가지 동결 방지제의 20-25 % w / w 용액 근처에는 순 팽창 또는 수축이 나타나지 않는 것으로 예측됩니다. 부피 변화 대 농도의 기울기는 물의 4 면체 저온 구조에 대한 추가적인 동결 방지제의 효과가 가장 두드러지는 40 % w.......
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토론
그럼에도 불구하고 장비 제작 도구 및 기계류에 대한 접근이 제한적인 학부생에 의해 주로 개발 된 본 장치 및 방법은 50pL만큼 작은 개별 액체 방울에 대해 매우 정확한 밀도 측정을 제공합니다. 유리화 된 시료를 얻기에 작은 냉각 속도가 충분한 50 % w / w 이상의 농도 범위에서 벌크 시료에 대한 이전의 측정에서 얻은 밀도와 일치합니다. 현재 밀도가 0 % 농도 - 순수한 것으로 외삽 된 것은 또한 77K에서 저밀도 비정질 얼음의 허용 밀도와 상당히 잘 일치한다.
주어진 혼합물을 중성으로 부양 시키는데 필요한 최종 N - Ar 밀도에 따라, Ar 흐름의 30 분 내지 5 시간 사이에 필요한 N2 - Ar 혼합물을 생성시켰다. 이 시간은 디퓨저 또는 다중 가스 튜브를 사용하여 Ar mixin의 표면적을 증가시킴으로써 줄일 수 있습니다g을 극저온 액체에 넣었다. 중성 부력으로 낙하가 확인 될 때까지 N 2 -Ar 밀.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 MCB-1330685 상을 수상한 NSF의 지원을 받았다. DWM은 Cornell University의 분자 생물 물리학 훈련 보조금 (NIH T32GM0082567)의 부분 지원을 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 원심분리기 튜브 | Falcon | 6029236 | 15 mL 원뿔형 원심분리기 튜브 |
| 글리세롤, >99.5% | Sigma | G9012-100 mL | |
| 에틸렌 글리콜, >99.8% | Sigma | 324558-100 mL | |
| 분석 마이크로 저울 | Mettler | AE240 | 분석 저울, 0.01 mg 해상도, 저울 아래에서 무게를 측정하기 위해 바닥에 후크가 있습니다 |
| vortexer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |
| 장치 인클로저 프레이밍 | Unistrut | 1-5/8" 메탈 프레이밍 | 48" 너비 x 24" 깊이 x 40" 높이 |
| 장치 인클로저 공기 장벽 | 투명 플라스틱 시트 | ||
| 네오프렌 고무 디스크 | 4 "직경, 1/8 "두께 | ||
| 듀어 플라스크 | Scilogix Dilvac | SS333 | 4.5 리터 듀어 플라스크 (스틸 케이스 및 클램프 뚜껑 |
| 구리 챔버 | 포함)이 제작된 부품은 1.43" 직경, 0.017" 벽 두께의 구리 튜브로 구성되어 있으며, 한쪽 끝을 밀봉하기 위해 납땜된 단단한 원통형 구리 기반이 있습니다. 구리 베이스의 높이는 0.87인치이고 전체 챔버 높이는 7인치입니다. | ||
| 질소 가스 | Airgas NI HP300 | 99.998% 순수 N2 가스 | |
| 아르곤 가스 | Airgas | AR HP300 | 99.998% 순수 Ar 가스 |
| 로타미터 | Omega | FL3692ST | 2.52 L/min 최대 유량 |
| 폼 절연 뚜껑 | 이 부품은 4 lb/ft3 가교 폴리에틸렌 폼(Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH)이며, OD는 2.42", ID는 1.52", 두께는 0.79"입니다. | ||
| PTFE 테스트 질량 | 이 제작된 부품은 0.246" 직경, 0.580" 높이의 실린더로, 실린더 축이 한쪽 끝에서 ~0.10"에 수직으로 교차하는 0.060" 직경의 구멍 | ||
| 마이크로밸런스 플랫폼 | Unistrut | 1-5/8" 메탈 프레이밍 | 11" 넓이 x 24" 길이 x 24" 높이 직사각형 프레임, 상단 알루미늄 시트, 그리고 모노필라멘트를 위한 구멍이 있는 테스트 질량 |
| 2 mil (50 um) 모노필라멘트 라인 | 버클리 | NF1502-CM | 나노필 낚싯줄 |
| 아르곤 프리쿨링 코일 튜빙 | VWR | 60985-512 | 1/8" ID x 1/4" OD PVC 튜빙 |
| 1.4" 직경의 펀칭된 구리 호일 믹서 | , 35 마이크론 두께의 구리 디스크, 1 온스/피트2 구리 시트에서 절단하고 송곳이나 다른 날카로운 뾰족한 도구를 사용하여 구멍으로 구멍을 뚫습니다. 직경 1-2mm의 단단한 단열(플라스틱 또는 목재) 막대를 중앙에 삽입하고 필요에 따라 에폭시를 사용하여 고정합니다. | ||
| 주사기 | BD | 309628 | 1 mL Luer-Lok 팁 주사기 |
| 진공 발생기 | Gast | VG-015-00-00 | 압축 공기 벤투리 단단계 진공 발생기 |
| 소수성 코팅 스프레이 | RainX | 620036 | 플라스틱 방수 |
| 롱 초점 거리 스테레오 현미경 | Bausch and Lomb 스테레오줌 6 | 0.67-4 x 줌 팟 20X 접안경, 10 cm 작동 거리& 주의; | |
| LED 링 일루미네이터 | Amscope | LED144S | |
| LED 스폿 일루미네이터 | Newhouse Lighting | NHCLP-LED | 3W LED 구즈넥 클램프 램프 |
| 1.8ml 극저온 바이알 | Nunc | V7634-500EA | 1.8 또는 2mL 극저온 이온이 적합합니다. |
참고문헌
- Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of Cryopreservation by Vitrification. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. , 21-82 (2015).
- Nagy, Z. P., Nel-Themaat, L., Chang, C. -C., Shapiro, D. B., Berna, D. P. Cryopreservation of eggs. Human Fertility: Methods and Protocols. , 439-454 (2014).
- Kriminski, S., Caylor, C. L., Nonato, M. C., Finkelstein, K. D., Thorne, R. E.
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재인쇄 및 허가
