用于细胞培养应用的蛋白基水凝胶结构的简便调控

摘要

本文针对基于蛋白质的水凝胶中调控三维结构的不同方法，从材料特性角度进行了评估。将大孔网络功能化修饰以细胞黏附肽，并利用两种不同的模式细胞系评估其在细胞培养中的可行性。

摘要

水凝胶因其能够提供高度水合的细胞环境，被公认为是细胞培养应用中有前景的材料。由于这类材料有可能模拟天然细胞外基质，三维模板领域正迅速发展。基于蛋白质的水凝胶尤其具有潜力，因为它们易于功能化，并可形成具有可调物理化学性质的特定结构。然而，使用天然材料制备用于细胞培养的宏观多孔三维模板，常受限于其机械性能较合成材料更弱。本研究评估了多种方法，以制备基于牛血清白蛋白（BSA）的多孔水凝胶体系，其孔径半径可在10至70 µm范围内调节。此外，建立了一种在该蛋白质材料中生成长达数百微米通道的方法。研究分析了不同成孔方法以及孔径大小对材料性能（如溶胀比、pH值、温度稳定性及酶降解行为）的影响。采用共聚焦激光扫描显微镜对水凝胶在天然溶胀状态下的孔径进行了表征。通过在蛋白质体系中引入细胞黏附性RGD肽修饰，并结合两种模型细胞系——人肺癌细胞（A549）和人腺癌肺泡基底上皮细胞（MCF7），评估了该材料在细胞培养应用中的可行性。

引言

水凝胶是一类能够形成不溶性三维网络结构并结合大量水分的材料。这类材料可为活细胞提供优良的环境条件。目前，人们对构建三维水凝胶结构以及开发调控其化学和物理特性的方法日益关注。一旦实现这些目标，便可为细胞生长及细胞行为的调控提供理想的模板^1,2,3,4。这些三维结构不仅比传统的二维培养方法更接近自然、更真实，还为干细胞或肿瘤模型的培养开辟了新的可能性⁵。不同材料具有多种特性，主要取决于凝胶的孔径大小⁶。孔隙在细胞培养应用、组织工程以及干细胞定向生长中起着关键作用。例如，氧气和营养物质需通过基质扩散，并确保足够量能够到达细胞⁷；另一方面，有害代谢产物必须尽快被清除，同时需提供充足的细胞生长空间⁷。因此，材料的特性，尤其是孔径大小，显著影响基质的潜在效益及其可能的应用范围。根据材料特性的不同，三维细胞培养中可能发生多种细胞生长过程，包括神经结构的形成、皮肤或骨细胞的生长与分化，以及肝细胞或成纤维细胞等特定干细胞系的定向生长^2,<....

方案

1. 水凝胶制备

1. 将 200 mg BSA 与 1 mL 去离子 H₂O 混合，配制 20% (w/v) BSA 储液（储液 A）。
2. 将 165 µL THPC 溶液（134 mg/mL）与 4.835 mL 去离子水混合，配制 THPC 储液（储液 B）。
3. 称取 1 mg KCSSGKSRGDS（1,111.1 g/mol）多肽（或等效的细胞黏附多肽），溶于 100 µL 无菌 H₂O 中，得到 10 mg/mL 溶液（储液 C）。
   注意：此步骤为可选步骤，仅当水凝胶用于细胞培养应用时才需进行。
4. 取一个 96 孔板，移除其底部，并用可剥离的塑料膜替代。
   注意：对于本实验所用的 96 孔板，可通过向每个孔的底部施加压力轻松移除底部；薄塑料底部会自行脱落。
5. 在 96 孔板中加入 100 µL BSA 储液（A）和 100 µL THPC 储液（B）（如需制备功能化、具有细胞黏附性的水凝胶，可额外加入 4 µL 储液 C），总体积为 200 µL 水凝胶。通过移液器上下吹打至少 5 次，确保各组分充分混合，以保证聚合后形成均匀的水凝胶。
6. 将 96 孔板置于室温（RT）约 10 分钟，直至所有水凝胶完全聚合。
7. 小心缓慢地从孔板底部剥离塑料膜。
8. 使用小型冲压工具将水凝胶从 96 孔板中推出，并转移至含有无菌 PBS....

结果

水凝胶的开发已成为材料科学研究相关生物学领域中最突出的研究方向之一，科学文献数据库中已有数千条相关记录。尽管许多体系的行为已被深入研究，但在材料科学中，三维网络的操控——尤其是对敏感的蛋白质基材料的操控——常常是一个主要难题。另一个常被低估的挑战是使用冷冻电子显微镜准确测量材料的天然结构。这是因为样品制备（即干燥）过程往往会改变水凝胶的性质。为克服这一问题，本研究采用共聚焦显微镜对材料样品进行分析，该方法能够在材料处于天然、吸水溶胀的状态下对其进行表征。罗丹明B可通过静电相互作用结合到水凝胶骨架上，从而有助于材料的可视化。为了探究采用冷冻干燥方法调控该蛋白质基体系的可行性，将水凝胶分别在液氮中-196 °C和-20 °C条件下聚合并冷冻。结果显示，冷冻温度对最终孔径大小具有明显影响。在-196 °C条件下，形成的孔径较小，半径约为10 µm，且尺寸分布较窄。相反，在较高温度下冷冻则会产生孔径更大的材料，其半径介于50至70 µm之间，如图1所示。缓慢冷冻过程会形成较大的冰晶，冰升华后便在材料内部.......

讨论

制备大孔基质对许多不同领域具有重要意义。由于水凝胶具有明确的结构，并且能够控制和调节特定的材料性能，因此其在技术和经济上均具有巨大潜力。然而，在三维模板中引入超分子结构单元（如孔隙或通道）可能会影响材料的整体性能，例如溶胀比或刚度。这可能导致网络结构发生不希望的分解、降解或破坏，从而使材料无法使用或不适用于预期的应用¹²。蛋白质因其结构明确、固有的生物相容性（因其来源于天然物质）以及存在大量可修饰位点（例如，活性氨基、羟基或羧基）而在水凝胶应用中展现出已知的潜力。然而，与合成水凝胶相比，许多基于蛋白质的水凝胶缺乏足够的机械稳定性¹⁶。由于引入大的三维结构可能导致水凝胶完全结构解体，因此必须严格评估调控三维结构方法的可行性，以获得理想的材料性能，并充分发挥蛋白质材料的潜力。这正是本研究评估冷冻干燥和粒子沥滤工艺及其对蛋白质水凝胶最终性能影响的原因之一。

在使用水凝胶时，一个关键问题是材料在宏观尺度上的可视化。通常采用基于电子显微镜的方法来观察水凝胶的三维结构。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲液（PBS）	Thermo Fisher Scientific	10010023
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基（高糖）	Life Technologies / Thermo Fisher	11140-050
胎牛血清（FBS）	Life Technologies / Thermo Fisher	10270-106
青霉素-链霉素	Life Technologies / Thermo Fisher	15140122
MEM 非必需氨基酸溶液	Sigma Aldrich	M7145-100ML
0.05% 胰蛋白酶 EDTA 酚红溶液	Thermo Fisher Scientific	25300062
99.8% 乙醇，vergällt	Ölfabrik Schmidt	2133
NaCl	Carl Roth	9265.1
白蛋白 V 组分	Carl Roth	3854.2
THPC	Sigma Aldrich	404861-100ML	有毒
0.1% Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ML	轻度毒性
鬼笔环肽-罗丹明	Life Technologies / Thermo Fisher	R415
3.7% 甲醛	Life Technologies / Thermo Fisher	F8775-25ML	有毒
罗丹明 B	Sigma Aldrich	81-88-9
Filtropur S 0.2	Sarsted Ag und Co.	2 83.1826.001
µ slide 8 孔板	Ibidi GmbH	80826
KCSSGKSRGDS 肽	UPEP Ulm	定制合成
99.8% 乙醇，vergällt	Carl Roth	K928.5
Falcon 5 ml 聚苯乙烯圆底管	Sarsted Ag und Co.	62.547.254
50 ml 离心管	Sarsted Ag und Co.	62.547.254
1.5 ml 离心管	Sarsted Ag und Co.	72,690,001
2 ml 离心管	Sarsted Ag und Co.	72,691
细胞培养微孔板，96 孔，聚苯乙烯，平底	Greiner	655073
冷冻干燥机 Epsilon 1-6D	Christ, Osterode am Harz, Germany
共聚焦激光扫描显微镜	Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
Zen 软件版本 2012 Sp1，黑色版，407 版本 8.1.0.484	Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany
GSA 图像分析软件，GSA Image Analyzer，GSA，版本 419 3.8.7	GSA GmbH