וזמינותו ביולומינסנציה במבחנה כדי לקבוע סלולארית בשעון הביולוגי בתאי אפיתל החלב מוצג. שיטה זו משתמשת בתרבית של תאים כתב פלסמידים לבטא גרם אולי לפגיעה ביציבות לוציפראז תחת השליטה של האמרגן ג'ין תקופה 2 . זה ניתן להתאים את סוגי תאים אחרים כדי להעריך את ההשפעות איבר ספציפי על שעון ביולוגי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
במבחנה ביולומינסנציה Assay לאפיין בשעון הביולוגי בתאי אפיתל החלב
במאמר זה
סיכום
תקציר
שעון ביולוגי הוא היסוד תהליך פיזיולוגי נוכח כל האורגניזמים מווסת תהליכים ביולוגיים החל ביטוי גנים לישון התנהגות. גולגולת, שעון ביולוגי נשלטת על ידי מתנד מולקולרית המתפקד הן תצלובתי (SCN; קוצב הלב המרכזית) והן תאים בודדים הכוללת רקמות היקפיים ביותר. חשוב מכך, שיבוש בשעון הביולוגי על ידי חשיפה לאור בלילה, לחצים סביבתיים ו/או חשיפה לרעלים משויך סיכון מוגבר של מחלות כרוניות והזדקנות. היכולת לזהות סוכנים יכול לשבש שעונים ביולוגיים מרכזי ו/או ציוד היקפי, וסוכני שניתן למנוע או להקטין את ההשפעות של שיבוש היממה, השלכות משמעותיות לצורך מניעת מחלות כרוניות. אף על פי מודלים מכרסמים יכול לשמש כדי לזהות חשיפות וסוכנים לגרום או למנוע/לצמצם שיבושים היממה, ניסויים אלה מחייבים מספרים גדולים של בעלי חיים. מחקרים in vivo גם דורשים תשתיות ומשאבים רבים, והן דורשות לחוקרים לעבוד כל הלילה. לפיכך, יש צורך דחוף עבור סוג התא המתאים במבחנה מערכת עבור הסביבה משבשים היממה, משפרי סוגי תאים מסך של איברים שונים ועם מצבי מחלה. אנחנו נבנה וקטור שמניע שעתוק של לוציפראז destabilized התאים האיקריוטים תחת השליטה של האמרגן גנים אנושיים פרק 2 . המבנה הזה, כתב היממה היה transfected stably לתוך תאי האפיתל החלב אדם, היממה כתב מגיבים תאים נבחרו כדי לפתח את הבדיקה ביולומינסנציה במבחנה . כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי ליצור ולאמת וזמינותו. בהמשך, אנו מספקים פרטים להוכחת ניסויים קונספט להפגין את יכולתם של שלנו assay במבחנה מסכם את הדברים ויוו השפעת כימיקלים שונים על השעון הביולוגי הסלולר. התוצאות מצביעות על כך וזמינותו ניתן להתאים מגוון רחב של סוגי תאים על המסך עבור משבשים סביבתיים והן משפרי chemopreventive משעונים היממה.
מבוא
השעון היממה מווסת את מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים ההשתנות היומית הביטוי של הגנים לשכב התנהגות בקצב צפוי תקופתיות של 24 ח' אפידמיולוגיים מחקרים ממליצים כי הפרעה כרונית של היממה קצב מגביר את הסיכון של השד, סרטן הערמונית אצל עובדי משמרת, כולל אחיות וטיסה קרוז1,2,3. ממצאים אלה הם שחלקית מחקרים מכרסמים, הוכחת חשיפה מתמדת אור, אור בלילה, או אור מחזורים לחקות ג'ט-לג עלייה גידול שכיחות ומאיץ הגידול צמיחה4,5. על סמך נתונים ממחקרים אנושיים וטכנולוגיים מכרסמים, הסוכנות הבינלאומית לחקר הסרטן המסווגים עבודה במשמרת קרצינוגן אדם ס....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הבנייה של PER2 יזם מונע גרם אולי לפגיעה ביציבות לוציפראז כתב וקטור
- לרכוש מותאם אישית pLS [hPER2P / rLuc / פורו] וקטור שמכיל cDNA קידוד rLuc האדם PER2 יזם פרגמנט (hPER2P, 941 bp) באתר בין שק הינד השלישי ב אזור שיבוט מספר 17 ואני.
- חתך השבר האנושי של יזם PER2 (hPER2P, 941 bp) מתוך הווקטור.
- µL להוסיף 2.5 אנזים הגבלה מאגר, 10 µL (180 ng) pLS [hPER2P / rLuc / פורו] וקטור, 1 µL כל של אנזימים ההגבלה, Sac I (יחידה 10/µL) ו- III הינד (10 יחידות/µL), לתוך ה-DNA/RNA/נוקלאוטיד ללא צינור microcentrifuge. להוסיף מים הנדס....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ביולומינסנציה היממה כתב וקטור: PER2 מונחה יזם הביטוי האנושי לוציפראז גרם אולי לפגיעה ביציבות משתנה
רצף הדנ א הכוללת קטע bp 941 נגזר האמרגן PER2 האדם נהגו לבנות הווקטור כתב היממה, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo, נותחו לראשונה לנוכחות של הרגולציה מרכיבים הידועים לווסת ביטוי גנים היממה. ביואינפורמטיקה ניתוח הראה כי בתוך שבר זה יזם, ישנם שלושה Bmal1 מחייב אתרים שונים (E-box) (החתול/CGTG), שני שעתוק היממה וחלו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בתרבית של תאים, תקופתיות של שעון היממה מוסדר על ידי לולאות משוב תעתיק/translational מחובררים. Heterodimers של Bmal1, שעון או Npas2 לווסת שעתוק היממה על-ידי איגוד E-box רכיבי ב היזמים של ליבה הרמטכ ל, כולל Per2 לבכות, ואני CCGs רבים4. ככל שהם צוברים בתא, heterodimers של כל: לבכות post-translationally שונה, מועבר לגרעין להדחיק פעילות גנים ברמת השעתוק השעון: Bmal1. לולאת משוב שלילי זה מאפשר הליבה סג ש לווסת את תמלול שלהם ולהגדיר את הביטוי האומנותית של הרמטכ ל, CCGs.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי 2012 החברה של רעלים (אויל)-קולגייט פלמוליב מענק למחקר Alterative (פאנג מ') ועל המחקרים שיתוף פעולה בינלאומי קרן חיה, צמח הסגר סוכנות, הרפובליקה של קוריאה (פאנג מ'), ולהעניק NIEHS P30ES005022 (ה Zarbl). ברצוננו להודות ג'נג ד ר צ'ן (מקגוורן הספר לרפואה של האוניברסיטה של טקסס למדעי הבריאות במרכז יוסטון) לדיון מועיל שלו, מר חואן Shao-An על עזרתו ניסיוני, גב' נקאטה Kimi לקריאה הוכחה שלה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| pLS [hPER2P / rLuc / Puro] וקטור | SwitchGear גנומיקה | S700000 | וקטור מותאם אישית |
| pGL4.18 [Luc2P / Neo] וקטור | Promega | 9PIE673 | וקטור ביטוי לוציפראז לא יציב |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224041 | לשיבוט תת שיבוט |
| TOPO TA | Invitrogen | K4500-02 | עם זריקה אחת TOP10 מוכשר כימית E. coli |
| Sac I | ניו אינגלנד BioLabs | R0156S | אנזים הגבלה |
| Hind III-HF | ניו אינגלנד BioLabs | R3104S | אנזים הגבלה |
| CutSmart Buffer | New England BioLabs | B7204S | מאגר אנזים הגבלה |
| ערכת מיצוי ג'ל | DNA Qiagen | 28704 | טיהור שברי DNA מג'ל אגרוז |
| ערכת טיהור PCR | Qiagen | 28104 | DNA לנקות |
| השינוי של LB Miller | TEKNOVA | L8600 | לתרבית E. Coli טרנספורמציה |
| LB Agar Plate | TEKNOVA | L1902 | לבחירה לבנה/כחולה |
| QIAprep ספין miniprep ערכת | Qiagen | 27104 | למיצוי DNA פלסמיד |
| EndoFree פלסמיד מקסי ערכת הכנה | Qiagen | 12362 | למיצוי DNA פלסמיד |
| FuGene HD | Promega | E2311 | מגיב טרנספקציה |
| Opti-MEM מדיום סרום מופחת | Invitrogen | 31985-062 | עבור טרנספקציה |
| MCF10A קו תאים | אמריקאי CRL-10317 | תאי אפיתל חלב | |
| MEGM BulletKit | Lonza | CC-3150 | מדיום גידול אפיתל חלב |
| MEBM | Lonza | CC-3151 | חלב אפיתל בסיסי בינוני |
| MEGM SingleQuot ערכת Lonza | CC-4136 | תוספות & ריאגנט גורמי גדילה | |
| Lonza | CC-5034 | מגיב לתת-תרבות | |
| D-PBS (10X) | Sigma | D1408 | לשטוף תאים בכלי תרבית |
| מים מזוקקים UltraPure | Invitrogen | 10977 | לדלל 10X D-PBS |
| צלחת תרבית רקמות (35 מ"מ) | BD/Falcon | 353001 | צלחת תרבית תאים המתאימה לגריז סיליקון LumiCycle |
| פישר | NC9044707 | לאיטום צלחת עם מדיום הקלטה | |
| זכוכית כיסוי עגול | הרווארד ביוסיינס | 64-1500 (CS-40R) | לאיטום צלחת עם מדיום הקלטה |
| רעלן כולרה | סיגמא | C8052 | תוסף למדיום גידול |
| G418 סולפט (גניטיצין) | אנטיביוטיקה Invitrogen | 10131035 | לבחירת תאים שעברו טרנספטציה |
| סטבלי אמפיצילין | סיגמא | A9393 | לבחירת מושבה |
| פורסקולין | סיגמא | F6886 | סוכן סנכרון |
| מלטונין | סיגמא | M5250 | סוכן סנכרון |
| דקסמתזון | סיגמא | D4902 | סוכן סנכרון |
| סרום סוסים | סיגמא | H1138 | סוכן סנכרון |
| d-לוציפרין, מלח נתרן | Invitrogen | L2912 | מצע לוציפראז |
| IC261 | Sigma | 10658 | בקרה חיובית על משבש צירקדי |
| Methylnitrosourea (NMU) | Sigma | N1517 | מסרטן ספציפי לחלב |
| מתילסלנוציסטאין (MSC) | Sigma | M6680 | סלניום אורגני (חומר כימו-מונע) |
| EX527 | מעכב ספציפי ל-Sigma | E7034 | SIRT1 |
| קמבינול | סיגמא | C0494 | SIRT1 & מעכב SIRT2 |
| NanoDrop ספקטרופוטומטר | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 | כימות נוקלאוטיד |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | N805-0200 | לניסוי בביולוגיה מולקולרית |
| חממת CO2 | NAPCO | 8000 DH | לתרבית תאים ב-5% CO2 ב-37 מעלות; C |
| צנטריפוגה שולחנית עם מחזיר Eppendorf | 5430R | לניסוי בביולוגיה מולקולרית | |
| צנטריפוגה עם דלי נדנדה | Eppendorf | 5810 R | לתרבית |
| תאים מיקרוסקופ הפוך | Nikon | 80124 | ניגודיות פאזה אופציונלית |
| מכסה מנוע תרבית רקמות | Labconco | Class II A2 | BSL-2 מוסמך |
| LumiCycle 32 | Actimetrics | לא זמין | גלאי Luminoscence |
מקורות
- Akerstedt, T., et al. Night work and breast cancer in women: a Swedish cohort study. BMJ Open. 5 (4), e008127(2015).
- Parent, M. E., El-Zein, M., Rousseau, M. C., Pintos, J., Siemiatycki, J. Night work and the risk of cancer among men. Am J Epidemiol. 176 (9), 751-759 (2012)....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
