Method Article

رسم الخرائط على نطاق الجينوم من التفاعلات البروتين الحمض النووي مع تشيك-سيق في ساكاروميسز سيريفيسياي

DOI:

10.3791/55836

⸱

June 3rd, 2017

 , 
1Basic Sciences Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Biology, Indiana University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن تصف الكروماتين الانقسام الذاتية إلى جانب تسلسل عالية الإنتاجية (تشيك-سيق)، المناعية لونين (رقاقة) طريقة متعامدة لرسم الخرائط مواقع ملزمة البروتين الجينوم على نطاق واسع مع نوكليس نوكوكلياز (منيس) البروتينات الانصهار.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

رسم الخرائط على نطاق الجينوم من التفاعلات البروتين الحمض النووي أمر بالغ الأهمية لفهم التنظيم الجيني، وإعادة عرض لونين، وغيرها من العمليات المقيمين الكروماتين. الفورمالديهايد يشابك تليها لونين مناعي وارتفاع الإنتاجية الإنتاجية (X-تشيب-سيق) وقد استخدمت لكسب العديد من الأفكار القيمة في علم الأحياء الجينوم. ومع ذلك، X-تشيب-سيق لديه قيود مرتبطة مرتبطة كروسلينكينغ وسونيكاتيون. رقاقة الأصلي تجنب هذه العيوب عن طريق حذف تشابك، ولكن غالبا ما يؤدي إلى الانتعاش الفقراء من البروتينات المرتبطة الكروماتين. وبالإضافة إلى ذلك، فإن جميع الطرق القائمة على رقاقة تخضع لاعتبارات الجودة الأجسام المضادة. وقد استخدمت أيضا أساليب الأنزيمية لرسم خرائط التفاعلات الحمض النووي للبروتين، والتي تنطوي على الانصهار من البروتين من الاهتمام لانزيم تعديل الحمض النووي، لتعيين التفاعلات البروتين الحمض النووي. نحن في الآونة الأخيرة مجتمعة واحدة من هذه الطريقة، لونين الانقسام الذاتية (تشيك)، مع تسلسل الإنتاجية العالية كما تشيك-سيق. تشيك-سيق يعتمد على الانصهار من الكروماتين- أسوكالبروتين إاتد من الفائدة إلى نوكلياز ميكروكوكال (منيس) لتوليد استهداف الحمض النووي الانقسام في وجود الكالسيوم في الخلايا الحية. تشيك-سيق لا يقوم على إمونوبريسيانتاتيون وبالتالي التحايل على المخاوف المحتملة مع يشابك، صوتنة، لونين سولوبيليزاتيون، وجودة الأجسام المضادة مع توفير عالية الدقة رسم الخرائط مع الحد الأدنى من إشارة الخلفية. ونحن نتصور أن تشيك-سيق سوف تكون نظير قوي ل تشيب، وتوفير وسيلة مستقلة من أجل التحقق من صحة النتائج تشيب-سيق، واكتشاف رؤى جديدة في التنظيم الجيني.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

رسم الخرائط مواقع ملزمة من عوامل النسخ (تفس)، إعادة تشكيل الكروماتين، والعوامل التنظيمية الأخرى المرتبطة بالكروماتين هو المفتاح لفهم جميع العمليات القائمة على الكروماتين. في حين استخدمت المناعية لونين وارتفاع تسلسل الإنتاجية (تشيب-سيق) نهج لكسب العديد من الأفكار الهامة في علم الأحياء الجينوم، لديهم قيود ملحوظة. لقد أدخلنا مؤخرا طريقة بديلة، يطلق عليها الانقسام الداخلي لونين والإنتاجية العالية تسلسل (تشيك-سيق) 1 ، للتحايل على هذه السلبيات.

وغالبا ما يتم تنفيذ تشيب-سيق مع خطوة الفورمالديهايد الأولي يشابك (X- رقاقة-سيق) للحفاظ على التفاعلا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. جيل من سلالات الخميرة

  1. توليد سلالة الخميرة التي تحمل عامل الفائدة الموسومة مع منيس.
    1. ير تضخيم كاسيت منيس علامات من ناقلات المطلوب ( الجدول 1 ) باستخدام خليط التفاعل المحدد ( الجدول 2 ) وظروف الدراجات ( الجدول 3 ). مزيج 5 ميكرولتر من تفاعل ير و 1 ميكرولتر من 6X دنا تحميل الصبغة. تشغيل كل قسامة ير على هلام الاغاروز 0.8٪ في 120 V لمدة 40 دقيقة. حجم المنتج المتوقع هو ~ 2.3 كيلوبايت.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في حالة تجربة تشيك ناجحة، وتحليل الحمض النووي من قبل الاغاروز هلام الكهربائي تكشف عن زيادة تعتمد على الكالسيوم في تجزئة الحمض النووي على مدى الوقت، كما هو مبين من قبل تلطيخ والهضم النهائي النهائي من الحمض النووي الجيني. في بعض الحالات، لوحظ سلم من العصابات مماثلة لتلك التي شهدت مع هضم منيس التقليدية بعد هضم موسع. هذا هو الحال بالنسبة لتحليل شيك من Reb1، وهو عامل تنظيمي عام يربط المناطق المستنفدة النيوكليوسوم (ندرس) ( الشكل 2

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد أظهرنا أن تشيك يمكن تعيين فئات متنوعة من البروتينات الخميرة على الكروماتين، وتوقع أنه سيتم تطبيقها على نطاق واسع على عائلات مختلفة من صناديق الاستئناف وغيرها من العوامل ملزم الكروماتين في الخميرة. تشيك-سيق هو مفيد في أنه لا يتطلب كروسلينكينغ، لونين سولوبيليزاتيون، أو الأجسام المضادة. وهكذا، تشيك يتجنب التحف التي يحتمل أن تكون موجودة في X- رقاقة- سيق، مثل قطعة أثرية تشيبابل فرط 3 ، 4 ، و رقاقة الأصلي، مثل السلبيات كاذبة.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر مصطفى صالح وجاي توريغني على قراءة نقدية للمخطوطة وستيفن هان وستيفن هينيكوف للحصول على الإرشاد والدعم خلال تطوير تشيك-سيق وتطبيقه على مجمع الوسيط. ويدعم سغ من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01GM053451 و R01GM075114 و جيز هو معتمد من قبل صناديق بدء تشغيل جامعة إنديانا.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
استخدام بوليميراز الحمضالنووي عالي الدقةNEBN0447
TrackIt 1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلم الحمض النوويThermoFisher Scientific10488085
Taq DNA polymerase NEBM0273L
cOmplete Mini EDTA-خال من البروتياز كوكتيلSigma-Aldrich11836170001من المهم استخدام مزيج مثبط البروتياز الخالي من EDTA ، حتى لا تمنع انقسام MNase عن طريق استخلاب Ca2 + < / sup>.
PMSFACROS OrganicsAC215740010
Digitonin ، عالي النقاءEMD Millipore300410-250MGاصنع مخزونا بنسبة 2٪ عن طريق إذابة 20 مجم من الديجيتونين في 1 مل DMSO مع دوامة قوية.
بروتيناز K ، 20 مجم / ملإنفيتروجين25530049
RNase A ، 10 مجم / ملThermoFisher ScientificEN0531
حبات Ampure XPإنشاء حبات تشبه Ampure باستخدام بروتوكول منشور (المرجع 24).
رف مغناطيسي MagneSpherePromegaZ5342
يمكن من dNTPs Q5 لتضخيم الكاسيت. يمكن

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nat Commun. 6, 8733(2015).
  2. Chen, J., et al. Single-Molecule Dynamics of Enhance....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

ChEC seqProtein DNA InteractionsMicrococcal NucleaseYeast ChromatinGenome wide MappingCalcium ActivationDNA CleavageSPRI BeadsPhenol ChloroformAgarose Gel

Related Articles