我们描述了染色质内源性切割联合高通量测序技术（ChEC-seq），这是一种与染色质免疫沉淀（ChIP）正交的方法，利用微球菌核酸酶（MNase）融合蛋白在全基因组范围内定位蛋白质结合位点。
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方法文章
全基因组范围内利用 ChEC-seq 技术在 Saccharomyces cerevisiae 中绘制蛋白质-DNA 相互作用图谱
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摘要
摘要
全基因组范围内绘制蛋白质-DNA相互作用图谱对于理解基因调控、染色质重塑及其他染色质相关过程至关重要。通过甲醛交联、染色质免疫沉淀及高通量测序（X-ChIP-seq）的方法，已在基因组生物学领域获得诸多重要发现。然而，X-ChIP-seq存在明显的局限性，主要与交联和超声处理相关。天然染色质免疫沉淀（Native ChIP）通过省略交联步骤避免了这些缺陷，但通常导致染色质结合蛋白的回收率较低。此外，所有基于ChIP的方法均受限于抗体质量的影响。近年来，也发展了利用将目标蛋白与DNA修饰酶融合的酶学方法来绘制蛋白质-DNA相互作用图谱。我们近期将其中一种方法——染色质内源性切割技术（chromatin endogenous cleavage, ChEC）与高通量测序相结合，建立了ChEC-seq技术。ChEC-seq依赖于将目标染色质相关蛋白与微球菌核酸酶（MNase）融合，在活细胞中钙离子存在条件下实现靶向DNA切割。ChEC-seq不依赖免疫沉淀，因而规避了交联、超声处理、染色质溶解以及抗体质量等潜在问题，同时能够以高分辨率实现背景信号极低的精确图谱绘制。我们预期ChEC-seq将成为ChIP技术的有力补充，为验证ChIP-seq结果以及发现基因组调控新机制提供一种独立且可靠的方法。
引言
绘制转录因子（TFs）、染色质重塑因子及其他染色质相关调控因子的结合位点，是理解所有基于染色质过程的关键。尽管染色质免疫沉淀结合高通量测序（ChIP-seq）方法已被用于获得基因组生物学中的许多重要发现，但其存在显著局限性。我们近期提出了一种替代方法，称为染色质内源性切割结合高通量测序（ChEC-seq）1，以克服这些缺点。
染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）通常首先进行甲醛交联（X-ChIP-seq），以稳定蛋白质-DNA相互作用。然而，近年来多项研究表明，X-ChIP-seq会捕获短暂或非特异性的蛋白质-DNA相互作用2,3,4,5,6,7,8，从而导致假阳性结合位点的出现。此外，在X-ChIP-seq实验中常用的超声处理用于染色质片段化，但其优先剪切开放染色质区域，导致这些区域的片段回收存在偏差9,
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方案
1. 酵母菌株的构建
- 构建一种酵母菌株，使其所含的目的因子带有MNase标签。
- 从目标载体中PCR扩增MNase标签盒（表1) 使用指定的反应混合物（表2）以及循环条件（表3)。取5 µL PCR反应产物与1 µL 6X DNA上样缓冲液混合，将每份PCR样品在0.8%琼脂糖凝胶中以120 V电泳40分钟。预期扩增产物大小约为2.3 kb。
- 使用标准的醋酸锂转化法将扩增的标签盒转入目标菌株22 并进行筛选。
- 通过菌落PCR验证标签盒的正确整合。
- 配制指定的反应混合物（表4用于筛选的菌落数量。使用前保持在冰上。
- 使用无菌牙签或移液器吸头，从每个菌落中挑取一部分接种至PCR管底部。
- 将挑取的菌落置于高火微波加热1分钟。
- 加入50 µL PCR混合液（表4将适量溶液加入每个微波处理后的菌落中，用移液器吹打混匀。按照指定的循环条件进行PCR反应。表5).
- 将50 µL PCR反应产物与10 µL 6X DNA上样缓冲液直接在每个PCR管中混合。取....
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结果
在 ChEC 实验成功的情况下，通过琼脂糖凝胶电泳分析 DNA 可观察到随着时间的推移，DNA 断裂呈现钙依赖性增加，表现为条带拖尾以及基因组 DNA 最终被完全消化。在某些情况下，经过长时间消化后，可观察到类似于传统微球菌核酸酶（MNase）消化所呈现的梯状条带。Reb1 的 ChEC 分析即属于此类情况，Reb1 是一种结合于核小体缺失区（NDRs）的通用调控因子（图 2）。我们发现，对于通用调控因子（GRFs）而言，延长消化时间会导致快速切割的结合位点处信号丢失1。理想情况下，应选择基因组 DNA 条带尺寸减小并伴有高分子量拖尾现象的样本（例如 Reb1 ChEC 的 30 秒和 1 分钟时间点）用于测序，以避免信号随时间推移而减弱。
Reb1 ChEC-seq 实验中片段末端的可视化结果显示，与未添加钙的 Reb1-MNase 菌株以及在.......
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讨论
我们已证明，ChEC 可用于在染色质上定位多种类的酵母蛋白，并预计该方法将广泛适用于酵母中不同家族的转录因子（TFs）及其他染色质结合因子。ChEC-seq 的优势在于无需交联、染色质溶解或抗体。因此，ChEC 可避免 X-ChIP-seq 中可能存在的假象，例如超ChIPable假象3,4，以及传统ChIP中因蛋白溶解不完全导致的假阴性结果14。ChEC-seq 的主要缺点与所有酶融合方法相同，即需要构建融合蛋白。在芽殖酵母中可快速实现，但在多细胞生物中则更为繁琐。ChEC-seq 的另一局限性是无法直接用于组蛋白修饰的分析。然而，可将组蛋白修饰结合结构域与MNase融合并表达，从而实现利用ChEC-seq进行组蛋白修饰的定位。在此基础上，已有研究利用表位标签标记的组蛋白修饰结合结构域进行ChIP-seq，以绘制全基因组范围内的组蛋白修饰图谱26。
使用游离MNase对.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Moustafa Saleh和Jay Tourigny对本文稿的审阅，感谢Steven Hahn和Steven Henikoff在ChEC-seq技术开发及其应用于Mediator复合物研究过程中提供的指导与支持。S.G.的研究得到美国国立卫生研究院基金R01GM053451和R01GM075114的资助，G.E.Z.的研究得到印第安纳大学启动资金的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| dNTPs | NEB | N0447 | |
| Q5 高保真 DNA 聚合酶 | NEB | M0491L | 其他高保真 DNA 聚合酶（如 Phusion）也可用于片段扩增。 |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA 标准品 | ThermoFisher Scientific | 10488085 | |
| Taq DNA 聚合酶 | NEB | M0273L | |
| cOmplete Mini 无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合液 | Sigma-Aldrich | 11836170001 | 必须使用不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物，以避免通过螯合 Ca2+ 抑制 MNase 的切割活性。 |
| PMSF | ACROS Organics | AC215740010 | |
| Digitonin，高纯度 | EMD Millipore | 300410-250MG | 通过将 20 mg Digitonin 溶解于 1 mL DMSO 中并剧烈涡旋，配制 2% 储存液。 |
| 蛋白酶 K，20 mg/mL | Invitrogen | 25530049 | |
| RNase A，10 mg/mL | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
| Ampure XP 磁珠 | Beckman Coulter | A63880 | 可依据已发表的方案（参考文献 24）制备类似 Ampure 的磁珠。 |
| MagneSphere 磁力架 | Promega | Z5342 |
参考文献
- Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nat Commun. 6, 8733(2015).
- Chen, J., et al. Single-Molecule Dynamics of Enhance....
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重印与许可
