Summary
القدرة على الكشف عن دقة النصوص أو البروتينات في الأنسجة المورفولوجية أمر بالغ الأهمية لدراسة ما وفرة والتعريب المتصلة بعملية التنمية. هنا هو وصف لإجراءات واضحة تشريح أجنحة الخوادر. يمكن استخدام هذه الأجنحة كعينات في العديد من التقنيات (إيمونوهيستوتشيميستري، وفحص PCR، إلخ).
Abstract
وضع الجناح في melanogaster المورفولوجية نموذجا مثاليا لدراسة morphogenesis على مستوى الأنسجة. تطوير هذه الملاحق من مجموعة من الخلايا المسماة الجناح أقراص imaginal شكلت أثناء التطور الجنيني. في مراحل اليرقات تنمو أقراص إيماجينال، زيادة في عدد الخلايا وتشكيل هياكل طلائي مونولاييريد. داخل القضية الخوادر، برعم بأقراص إيماجينال وإضعاف في بيلاييرس على طول خط يصبح الهامش مستقبلا من الجناح. أثناء هذه العملية، تنشأ العروق الطولية بريموديا الخلايا المنطلق على السطوح الظهرية والبطني المحتملين من الجناح. خلال مرحلة الخوادر المشارب الخلايا الوريد لكل سطح الاتصال من أجل إنشاء أنابيب ضيقة؛ في الوقت نفسه، تبدأ عبر الأوردة تكونها.
بمساعدة الواسمات الجزيئية الملائمة، من الممكن تحديد العناصر الرئيسية يؤلف الجناح أثناء تطورها. ولهذا السبب، القدرة على دقة الكشف عن وقائع أو البروتينات في هذا الهيكل حاسم بالنسبة للذين يدرسون وفرة والتعريب المتصلة بعملية التنمية للجناح.
ووصف الإجراء هنا يركز على التلاعب بأجنحة الخوادر، توفير إرشادات مفصلة حول كيفية تشريح الجناح خلال مرحلة الخوادر. تشريح الأنسجة الخوادر أكثر صعوبة لأداء نظرائهن في يرقات الطور الثالث. وهذا السبب في وضع هذا النهج، للحصول على عينات سريع وكفاءة عالية الجودة. وترد تفاصيل عن كيفية إيمونوستين وجبل هذه العينات الجناح، للسماح للتصور من البروتينات أو مكونات الخلية، في البروتوكول. مع القليل من الخبرة من الممكن جمع 8-10 أجنحة الخوادر ذات جودة عالية في فترة قصيرة من الزمن.
Introduction
يتم تطوير أجنحة المورفولوجية من أقراص إيماجينال الجناح. البدائي لهذه الأقراص الجناح جانبا أثناء التطور الجنيني كمجموعات صغيرة من الخلايا إيماجينال 20-30 التي إينفاجيناتي من ظهارة الجنينية. بينما تنمو اليرقة إلى مرحلة الطور الثالث، يحدث الانقسام في الخلايا إيماجينال في أوقات محددة مميزة رفع عدد أعضائها (حوالي 50000 الخلايا) وتشكيل الجناح القرص1،2،3، 4. كما تتكاثر الخلايا، أنها أزياء من ظهارة أنبوبي، أدى إلى تصاعد ضغط ذاتية قابلة لطي. أثناء بوباتيون، ظهارة القرص التلسكوبات خارجاً للجناح شكل الطبقات اثنين وعروق طولية تبدأ كثغرات بينهما، الذي يحدث مرتين خلال الجناح الإنمائية5،6.
وقد ترتيب الأوردة دائماً نمط مماثل؛ القدرة على التعرف بسهولة على كل تغيير في تشكيل الأوردة يجعل الطفرات مرئية جداً (مثلاً مفقودة أو إضافية الأوردة، تغييرات في مواقف الوريد، إلخ.). من المثير للاهتمام، اختلافات النمط الظاهري هي عادة أدلة الطفرات في المكونات المعروفة أو الرواية من إشارات المسارات ذات الصلة لتطوير الجناح. واحد من المسارات التي تلعب دوراً في تحديد الموقف والحفاظ على السياق والأراضي إينتيرفين هو القنفذ (ح ح) المسار6،،من78.
ونظرا لأهمية الجناح الخوادر كنظام نموذجي، سيكون من المهم الحصول على عينات ذات نوعية جيدة للعمل مع. في الماضي، لم تول العلماء التي نشرت البروتوكولات تشريح أجنحة المورفولوجية دليلاً مناسباً لتحقيق نماذج قابلة للتطبيق. دون التوجيه من باحث واحد لا يمكن تصور وضوح العملية. في هذه النهج البديل تشريح تقسيم اثنين، الفصل بين الجناح من الأنسجة المحيطة عذراء وغسلها مرارا وتكرارا لإزالة الأنقاض. يلوث هذا النوع من النهج المطالبات بمغادرة الجناح مجاناً للكن العملية أبطأ بسبب التجربة السابقة وهناك فرصة أكبر للمساس بهيكل أجنحة هشة9.
وقد وضعته الإجراء الموضح هنا الطلب لإيجاد وسيلة سريعة وفعالة للحصول على عينات الجناح الخوادر مناسبة للكشف عن بروتينات محددة أو النصوص باستخدام بروتوكولات إيمونوديتيكتيون أو فحوصات بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (PCR). ولتوضيح ذلك، التعبير والترجمة من مرقع (المؤسسة العامة للاتصالات أو مستقبلات المتعارف عليه المسار سمو) تكتشف في عينات الجناح الخوادر، توفير بروتوكول يتضمن التفاصيل ذات الصلة القيام بنجاح الكامل الإجراء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 يوم
1-جمع واستزراع الخوادر.
- إزالة ح 0 بعد تشكيل بوباريوم (APF) أو بريبوباي باستخدام الرسام رطب من قنينات مثقف ووضعها في قارورة جديدة لإكمال فترة التنمية تقريبا (انظر 2-1 و 2، 2).
ملاحظة: ينبغي الإبقاء على صحة سكان من الذباب باستخدام البروتوكولات القياسية تثقيف. بعد ثلاثة أو أربعة أيام التي وضعت البيض، يمكن إزالة الكبار من قنينات للسماح تنمية مثلى للأفراد. أنها المحافظة على درجة حرارة ثابتة حتى تبدأ يرقات الطور الثالث بوبيشن. الانتقال اليرقات/الخوادر يتسم بتشكيل بريبوبا تعتبر ح 0 الإدارة العامة الاتحادية. بريبوبا هو يرقة بيضاء غير متحرك يحتوي مستطيل، مستديرة الشكل مع بروز spiracles الأمامي.
2 يوم
2-نقل والتشريح والتثبيت.
- نقل الخوادر (2 ح قبل الوقت التنمية كاملة) مع الرسام، إلى الشريحة المجهر مع الشريط على الوجهين التقيد بذلك. ضع الخوادر على شكل صف مع الجانبين الظهرية الرأسي وحتى ينتهي تواجه نفس الاتجاه.
- إرجاع الشريحة المجهر إلى درجة حرارة ثابتة والسماح الخوادر لإكمال الوقت الإنمائية المناسبة (أي 24-30 ح الاتحادية).
ملاحظة: وستكون الشريحة المجهر مع الشريط على الوجهين منصة تشريح عابرة لإزالة حالة الخوادر (انظر أدناه). مرور الوقت على الشريحة المجهر (خارج القنينة) يساعد على الجاف للقضية الخوادر يجعلها قابلة للكسر بسهولة بالملقط. - إزالة operculum من حالة الخوادر باستخدام الملقط.
- كسر الحالة مع الملقط (كما هو موضح في الفيديو) مما يجعل خط على طول الجانب من الخادرة إلى نهاية والذيلية. من الممكن مع الإضاءة المناسبة للكشف عن الشكل الداخلي لعذراء مما يجعل من الواضح مساحة فقط فوق المفصل الجناح الخوادر. هذه المساحة بمثابة دليل لإجراء فتح دون الأضرار عذراء.
- قم بإزالة أجزاء من القضية، التقاط لهم بفتح الحدود وتقلهم إلى الجانب الآخر حيث تعقد لهم الشريط على الوجهين. في نهاية التشريح سيكون الخوادر تقريبا "عارية"، فقط قطعة صغيرة من القضية سوف تغطي الحافة الخلفية.
ملاحظة: الغرض من ترك كمية صغيرة من القضية في نهاية والذيلية العلوي لضمان إصدار سلسة من القضية على الشريحة مع الشريط على الوجهين. الأسباب الكامنة وراء هذا الإجراء لأنه إذا قمت بإزالة كثيرا القضية إلى حد كبير خطر الأضرار عذراء. من ناحية أخرى إذا قمت بإزالة القليل جداً، الخادرة لن بسهولة تأتي خالية من القضية. - دفع إلى الأسفل (مع الملقط) ما تبقى القضية. سوف تثير هذه الحركة نهاية الأمامي من عذراء، السماح لكل من الرأس والصدر على البقاء في وضع تفضيلي إلى الالتزام وإلى نقلها في الخطوة اللاحقة.
- تأخذ شريحة جديدة مع الشريط على الوجهين وعكس ذلك على عذراء أو صف الخوادر. نوصي بتنفيذ هذا النهج عن طريق مراقبة التحركات مع المعونة من ستيريوميكروسكوبي منع الكسر الخوادر.
- اضغط قليلاً لجعل الخوادر العصا إلى الشريط وتنزلق الشريحة بلطف من أجل إزالة الخوادر من بقية الحالات. عكس الشريحة المجهر: سوف يكون عالقاً في الخوادر في الجهة الظهرية على مستوى رؤوسهم/منطقة الصدر.
- تغطي جميع الخوادر عارية مع بارافورمالدهيد 4% وانتظر 10 دقائق. في تجربتنا، هذه الفترة الزمنية مع مثبت يساعد على تغيير اتساق بشرة يجعلها ثابتة وأقل لزجة وسهلة للتعامل.
ملاحظة: القيام باستخراج الحمض النووي الريبي (الرنا)، بارافورمالدهيد بديل للفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع رناسي مجانية المياه وإزالة أجنحة الخوادر صنع قطع (مع معونة مقص) قرب النقطة المفصل لكل طرف من أطرافهم. باستخدام الملقط، نقل الجناح الخوادر لأنبوب ميكروسينتريفوجي مع 1 مل كاشف ثيوسيانات والفينول جوانيدينيوم. بعد تجميع مجموعة أجنحة 50-80، تخزين أنبوب ميكروسينتريفوجي في-80 درجة مئوية حتى أداء10،استخراج الحمض النووي الريبي11. - إجراء شق صغير في منطقة المفصل الجناح أو القريبة منها. تسمح مثبت للوصول إلى ظهارة الجناح. استخدام ماصة (p200) تدفق مثبت على الجناح. عند مسح استبدال يحملق الملوثة مع الجديد. بعد التنظيف، إبقاء الجناح في مثبت لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: على الرغم من أن هذه المناورة يساعد على مسح بعيداً غالبية الأنسجة تلويث، بعض هيموسيتيس وقطرات الدهون يمكن أن تبقى حبيسة بين طبقات طلائي الظهري والبطني الجناح (انظر الشكل 1A). - المسيل للدموع بالملقط من حدود بشرة (كما هو موضح في الفيديو) توسيع الثقب ويتيح الإفراج عن ظهارة الجناح من الكيس بشرة. حالما يتم تحرير الأنسجة الجناح، اتركه في حل بارافورمالدهيد لإكمال التثبيت و 30 دقيقة.
- نقل أجنحة ثابتة لواحد الصحن البلاستيك 4-وليد مليئة ببست (Triton X-100 0.05%). مخزن بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
3 يوم
3-الابتدائي جسم الحضانة.
- بيرميبيليزي الأنسجة تفرخ أجنحة الخوادر في ببست (Triton X-100 0.2 ٪) لمدة 15 دقيقة باستخدام منصة هزاز لتسهيل حركة متوسطة سائل لطيف.
ملاحظة: حتى تركيب العينات، ينبغي إجراء الخطوات باستخدام منصة هزاز. - كتلة العينات باستخدام ببستا (جيش صرب البوسنة 3 ٪، X-100 تريتون 0.1 ٪) ح 1.
- استخدم نفس المخزن المؤقت لتمييع جسم الأولية (الماوس المضادة-المؤسسة العامة للاتصالات، 1: 100)، واحتضان أجنحة الخوادر بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
4 يوم
4-الثانوية جسم الحضانة.
- تغسل العينات 4 × 10 دقيقة كل مع ببست (Triton X-100 0.05%)
- احتضان مع جسم الثانوية (مثلاً، الماوس المضادة مترافق ل fluorochrome) المخفف بتركيز مناسب في ببستا (جيش صرب البوسنة 3 ٪، X-100 تريتون 0.1 ٪) في درجة حرارة الغرفة في الظلام، وعن ح 2.
ملاحظة: إذا كان من المناسب، استخدام 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) و/أو فالويدين كونتيرستين الأنسجة. إضافة هذه المسابر مع الأجسام المضادة الثانوية مع مراعاة الطول الموجي الانبعاثات من فلوروتشروميس لمنع تداخل الإشارات. - تغسل العينات 4 × 10 دقيقة كل مع ببست (Triton X-100 0.05%)
5-تركيب
- إعداد شريحة عينة بوضع النقاط 4 من طلاء الأظافر الشفاف على الشريحة المجهر كما لو كانت القمم ساحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويوفر البروتوكول وسيلة مباشرة للحصول على عينات الجناح الخوادر التي تحتفظ مورفولوجية مألوفة للجناح. من هذه الأعمال التحضيرية من الممكن الحصول على أكوام من الصور التي يمكن أن يكون المتوقع كثنائي الأبعاد أو ثلاثي الأبعاد، للتحقيق في توزيع و/أو في إثراء البروتينات خلال التفريق بين الجناح. بروتوكول مماثل (راجع الملاحظة في 2.9) يمكن استخدام لجمع العينة الجناح الخوادر الكبيرة (التي تشمل 50-80 الخوادر أجنحة) اللازمة لتوليف مكملة الحمض الخلوي الصبغي (كدنا)، القالب المستخدم في ردود الفعل PCR.
الشكل 1 : القنفذ مسار الجينات في المورفولوجية أجنحة الخوادر
مصححة (A) ، كان تصور مستقبلات الكنسي لمسار القنفذ، في 24-30 ح APF استخدام الماوس مضادات كونتيرستينيد المؤسسة العامة للاتصالات-نوى مع DAPI بينما خيوط الأكتين هي تصور استخدام فالويدين الفلورية الخضراء. توزيع أكتين يساعد على ترجمة عروق الجناح وعلاقته بالتعبير مصححة . في الوقت نفسه، وصمة عار فالويدين يكشف عن وجود بعض هيموسيتيس وقطرات الدهون (الدوائر الكبيرة) كتلويث الأنسجة. 20 x التكبير، الأمامي. مقياس بار، 100 ميكرومتر (ب) أمبليكونس إلى أكتين (لين 1، 280 شركة بريتيش بتروليوم) و المؤسسة العامة للاتصالات (لين 2، 236 bp) تم الحصول عليها باستخدام سينثيتيزيد كدنا من الحمض النووي الريبي الرسول (مرناً) الجناح العينة التي تم إنشاؤها بواسطة بروتوكول تشريح مماثل. ميغاواط، والوزن الجزيئي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن استخدام طريقة التشريح الموصوفة في هذا الفيديو لتحضير عينات ذات جودة عالية من أجنحة المورفولوجية الخوادر من مراحل التنمية المختلفة لأنواع كثيرة من التقنيات (مثلاً، الفلورة، كدنا توليف لفحوصات بكر، في المختبر الجناح التنمية). فيما يتعلق بهذه الطريقة قد استخدمت العلماء المشاركين 24-30 ح الإدارة العامة الاتحادية. ومع ذلك ينبغي أن تكون هناك عقبة ضمن الخطوات الأساسية في تشريح عذراء الأصغر أو الأكبر سنا. قد تكون التغييرات لاستيعاب أصغر مرحلة الخادرة.
يمكن أداء البروتوكول تشريح عذراء واحدة أو عدة الخوادر في نفس الوقت. وهذا يساعد على الإسراع بهذا الإجراء، مما يجعل من الأسهل للوصول إلى عدد كبير من أجنحة تشريح. وفي هذه الحالة هناك الخيار لإزالة صف الخوادر 4-5 وفي الوقت نفسه. يمكنك إزالة الخوادر معا أو إذا كان من غير الممكن، الاستمرار في إزالة بشكل فردي على الشريحة نفسها (انظر الفرع الثالث من الفيديو: "تشريح الخوادر متعددة"). لإزالة عذراء عارية من فتح القضية، من المهم أن الحافة الخلفية صغيرة بما يكفي. فمن الممكن أن تشطب القضية تماما؛ على الرغم من أن من شأنه أن يجعل النقل أسرع، هو تحدي إزالة القضية برمتها، وهناك خطر أكبر من الأضرار عذراء.
تجربة ما تمليه مناورة هام للنظر هو ترك (ح 2 آخر لإكمال فترة التنمية المنصوص عليها) الخادرة يعلق على الشريحة المجهر داخل الحاضنة ولكن خارج القنينة. هذا انقضاء الوقت يساعد على الجاف للقضية مما يجعل من الأسهل لكسر. خطوة حاسمة أخرى أثناء تشريح إيمونوهيستوتشيميستري، هو تقشر بشرة يغطي ظهارة الجناح، مما منح الوصول لجسم على سطح الجناح كامل. هذه الخطوة ينبغي أن يتم بعد تحديد لعدة دقائق (على الأقل 5 دقائق بعد إجراء الشق في نقطة المفصلي) نظراً لأن مثبت تستقر في الأنسجة والتغييرات تناسق بشرة، مما يجعل من الأسهل قشر.
أثناء تنفيذ جميع الخطوات immunohistochemistry، يجب التأكد من أن الأجنحة في حركة مستمرة (هزاز منصة). الحركة يساعد على تحسين التبادل والاختراق من الحلول خلال يغسل وإينكوبيشنز. ومع ذلك، من المهم القيام بها بلطف تجنب حدوث التشوهات غير مرغوب فيها في مورفولوجية هذه البنية الهشة (أي، يكفي أن الذبذبات منهاج التحرك قليلاً تحتوي على المتوسط السائل العينات).
ويوفر هذا الإجراء نهج بديلة وتكميلية للأساليب المنشورة بالفعل لتشريح الجناح الخوادر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونود أن نشكر السفن للدعم المالي المقدم لهذا المشروع، ماريانا Di Doménico لها المساعدة التقنية مع الفحص المجهري [كنفوكل]؛ لخوسيه ليوناردو باييز التصويبات مخطوطة له؛ لكوريا لوتشيانو لتفانيه في خدمة إنشاء الفيديو؛ إلى ناتاليا Rosano للإقراض صوتها للفيديو و المورفولوجية بلومينغتون مركز الأوراق المالية توفير الأرصدة المستخدمة في هذه الدراسة. حصل من الضفة هيبريدوما الدراسات الإنمائية (دشب) تحت إشراف NICHD Apa1 [مونوكلونل] مكافحة--المؤسسة العامة للاتصالات المتقدمة من إيزابيل غيريرو ويحتفظ بها جامعة آيوا، قسم العلوم البيولوجية، 52242 مدينة آيوا، ألف.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ1000 | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Microscope slides | StarFrost | 8037/1 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Scissors | Lawton | 63-1400 | |
| Multi-well plastic dish | Thermo Scientific | 144444 | |
| p100 or p200 pipette | Finnpipette (Labsystems) | 9400130 | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| TRIzol Reagent | Ambion | 15596026 | |
| DEPC treated water | MO.BIO | 17011-200 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL (working dilution 1/800) |
Invitrogen | A11030 | |
| Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μg/mL (working dilution 1/100) |
Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. | |
| DAPI, 1 mg/mL (working dilution 1/5000) |
Invitrogen | 62248 | |
| Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol (1/600 working dilution) |
Invitrogen | A12379 | |
| Canton S (fly stock) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
- Serrano, N., O'Farrell, P. H. Limb morphogenesis: connections between patterning and growth. Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).
- Blair, S. S. Compartments and appendage development in Drosophila. Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).
- Klein, T. Wing disc development in the fly: the early stages. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).
- Beira, J. V., Paro, R. The legacy of Drosophila imaginal discs. Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).
- De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. Developmental basis for vein pattern variations in insect wings. Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).
- Blair, S. S. Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).
- Bier, E. Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development. Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).
- De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).
- Bolatto, C., et al. Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo. Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).
- Zuniga, A., et al. Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis. BMC Biol. 7, 61 (2009).
