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方法論記事

肝のパーティションを関連付けると段階的な肝切除 (ALPPS) プロシージャの門脈結紮ラットモデル

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DOI:

10.3791/55895

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2017年8月14日

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Physiology - Center for Integrative Human Physiology, University of Zurich, 2Department of Surgery, Rush University Medical Center, 3Department of Surgery, Cantonal Hospital Winterthur, 4Institute of Anesthesiology, University and University Hospital Zurich

この記事について

サマリー

段階的肝切除のため肝臓パーティションの関連付けと門脈結紮を使用して急速な肝肥大を誘発する境界線切除可能肝腫瘍の切除のため (ALPPS) が提案されています。このモデルは、急激な肥大に関与するメカニズムの解明が、再生の高速化、促進または薬剤のテストを可能に。

要約

最近の臨床データは、プライマリおよび転移性の肝腫瘍に積極的な外科的アプローチをサポートします。大腸癌肝転移のようないくつかの兆候の大きな切除または多発性肝腫瘍の主な制限要因となっている肝切除後肝組織の量が後ろに残って。ポスト肝切除術の重篤な合併症を避けるために必要な機能組織の最小限な肝不全、高い罹患率と死亡率を持っています。肝切除の前に将来の残成長を誘導するより定着して肝臓手術、インターベンション放射線科医によって門脈塞栓術の形でまたは門脈結紮切除術の前に数週間の形で。最近、肝再生より広範かつ急速に、最初の段階ではし、1 週間だけ待っている、第 2 ステージ (肝臓パーティションを関連付けることで切除後の門脈結紮に実質の断裂が追加されることが示されました。段階的肝切除のため門脈結紮 = ALPPS)。ALPPS は急速に人気となって、世界中が、その高周術期死亡率を批判されています。この手順による迅速かつ広範な成長のメカニズムはよくわからなかった。動物モデルは、ALPPS 加速肝再生の生理学的および分子メカニズムを探索する開発されています。このプロトコルは、加速再生の機構の探査ができるラット モデルを示します。

概要

肝臓の残りのサイズは、肝腫瘍の切除を制限します。1一般的なとき未満 25% 肝組織の背後に残っている、患者 (「小さすぎるサイズ症候群」) 全体の有機体の代謝機能の不足のため急性肝不全から死リスク増加になります。2このポスト肝肝不全は、肝切除後最も壊滅的な合併症。そのため臨床医は門脈の流れを操作することによって肝切除術前に肝再生を誘導するために試してみました。3門脈を閉塞すると、一度門脈血流の残りの部分は遅い速度で成長を開始し、それにより 60% までサイズを増やすことができますがわかった。4外科的結紮5またはインターベンショナル門脈閉塞が両方とも臨床的に確立されています。4ボリュームや肝臓の機能の増加、信頼性ですが肝部分切除後の残肝の成長に比べて肝臓ポータル閉塞がのみ約 5 分の 1 した後の成長率。6

成長する肝臓に必要な時間は数ヶ月に数週間肝臓を切除後、はるかに速い速度で再生成できます。このように、肝臓はそれの部分を除去した後正常に戻る育つ唯一の器官です。7同じようなペースで肝再生を誘導する部分的な hepactectomy が開発された後外科医のグループによって人は、閉塞間の離断を追加することを発見したし、非閉塞部肝臓肝臓を誘導する新規プロシージャ肝切除後、切除前と同じ成長速度で肥大します。9手順開始一週間以内の大規模な主に切除、肝腫瘍の切除を可能にする、将来的に肝週残内 80% の急速な肥大します。プロシージャを呼び出した「段階的肝切除ための関連付け肝臓パーティションおよび門脈結紮 = ALPPS」、世界中で急速に人気となった。10複数のレポートは、11複雑な手術もその高い合併症率批判された一方、新技術により境界線切除可能肝腫瘍の手術適応の拡大をサポートしました。12,13

2012 年より組織学的特性とメカニズムの理解を許可して薬の効果をテストする ALPPS の出版物以来、齧歯動物の開発、またゆっくりと急激な肥大の大動物モデルが試みられました、動物肝組織の異なる成長率。開発最初の動物モデルは、ラットのモデルだった。このモデルでは、右と中央の葉の左の部分の間の実質の断裂後の急激な肥大は右中央の葉の再生を加速しました。14別のモデルはマウスに後で導入されました。このモデルでは左葉外側切除し、肝左の中央葉以外のすべての葉の門脈枝が結ばれました。15一方で、豚の ALPPS の大動物モデル記載されているも.16

流量の変化と門脈血流、肝組織の酸素圧力のような生理学的メカニズムの研究、ラット モデルはマウスにおける ALPPS のモデルより優れています。マウスのモデルをラットのもう一つの利点は、ラットのモデルは左葉外側と ALPPS の肝切除術の効果を汚染することがあります15の切除の必要がないことです。ラットのモデルは対照的に肝臓を減らさない細胞塊。豚モデル成長葉として右後葉を使用しますが、豚肝臓、高い葉状。したがって、右後部と右前頭葉の間既に薄い組織橋で切除平面を作成することは困難です。対照的に、個別に各ポータル静脈によって提供される 2 つの部分から成っているラットの中葉と顕微鏡技術を使って 2 つの実質の断裂面を簡単に作成することができます。小さな動物のコンピューター断層撮影 (CT) および/または磁石共鳴画像 (MRI) の空室状況により追加切除と門脈結紮門脈結紮だけで体積の成長の非常に正確な定量化が重要であります。任意の急速な肝肥大モデルの検証。

ここに示すプロトコルを記述する手技と体積の検証および門脈結紮とを離断、門脈結紮後ゆっくりと急激な肥大のモデルの生理学的特性に使用するプロシージャそれぞれ、ラット。

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プロトコル

このプロトコルのすべての実験は、チューリッヒ、スイス連邦共和国のカントンの獣医当局によって承認された (番号 60/2014)。さらに、実験の手順をすべて行った動物実験に関するガイドライン」を遵守してスイス アカデミーの医療科学 (SAM) とガイドラインの連合の欧州研究所動物科学協会 (FELASA).

1. 畜産、手術室設備・機器、麻酔

  1. 12/12 時間の明暗サイクルに換気ケージ病原体フリーの標準的な条件下でのラット 250-300 グラムの重量をしてください。食料と水は常温 22 ± 動物無料アクセスを与える 1 ° C
  2. 30 5 vol % とイソフルランをフラッシュする場所ボックスで麻酔作用 s (図 1 a)、動物は深い麻酔下まで 3 vol % のイソフルラン麻酔濃度が続きます。つま先ピンチ反射によって麻酔のレベルを確認します。
  3. 皮下を使用して鎮痛が続いて 0.02 mg/kg 12 時間間隔 48 時間術後の段階では、外科的介入時にブプレノルフィン (0.01 mg/kg) を適用を提供します。
  4. 彼らが自発的に呼吸 1.0 2.5 集 % イソフルランの酸素の混合ガスにさらされる作業場所に動物を転送 (流れ: 600 mL/分)。
  5. 動物の目を閉じて、目を保護するために、軟膏を使用します。5 mL の生理食塩水を皮下注入、腹部の両側にそれの半分に 0.1 mg アトロピンによって続いた。
  6. 手術室で手術顕微鏡を使用して手術を行います。
  7. ラットの鼻をプッシュするラテックス膜 (図 1 b) から成る換気マスクを使用して揮発性麻酔下で動物を飼います。テープ (図 1 b) と四肢を修正します。
  8. サイド テーブルの滅菌方法で手術器具のレイアウト: 腹壁と剣、はさみ、アドソンの撤回のための 3-0 縫合糸だけでなく、生理食塩水に Betadine を浸したスポンジ (図 2 a) 腹部壁のリトラクター (図 2 b)鉗子、罰金のヒント microforceps のストレート湾曲し、結紮プロシージャ (図 2) の 6-0 シルク ネクタイをカット済み。
  9. 肝実質の断裂に非付着バイポーラ microforceps を使用します。腹壁と SH 1 針と 5-0 Maxon (図 2 D) 3-0 シルク縫合糸を使って皮膚を閉じます。止血バイポーラ鉗子を使用します。

2. 手術の開始

  1. 正中線の外側を 2 cm エリアで性器に、剣から小動物の毛のクリッパーの動物の腹部を剃る。徹底的に髪を削除します。
  2. Betadine 浸したスポンジで 3 回この地域を消毒します。
  3. 肌にメスを用いた正中切開を行い、手術用のはさみを使用して腹部を開きます。
  4. 右と左の腹壁と縫合糸 3-0 シルク (図 3 a) で剣を撤回します。
  5. 胃・大腸・小腸自作小さいワイヤー リトラクター (図 3 b) によるラットの肝十二指腸間膜からを撤回します。

3. 門脈結紮 (PVL)

  1. 胃および小腸 (図 3 b) の横方向の収縮によって門脈分枝にアクセスします。
  2. にべもなく、microforceps と腹膜を拾い、ゆっくりと内側に剥離によって門脈を解剖します。
  3. 次の順序で (図 3) を門脈枝を分析: (1) 右後枝、(2) 横方向と左中央支店を一緒に、左と (3) 尾状葉枝。
    1. 最初に、腹膜の取材で直接実行される肝葉に小さな動脈枝を引き裂くことを避けるために小さい、ないあまりにも精力的な動きで腹膜をはがします。
    2. 門脈は裸、遅い前方を押しながら枝を取り囲む、拡散運動し、プル 6-0 シルクの 1 cm 作品それぞれの門脈枝のまわりで結ぶし、それを縛る。
  4. 右後頭葉枝を縛る。(図 3)右後枝の技術的な難しさは、右後頭葉動脈は右後方の門脈枝にまたがって実行されてという事実で成っています。
    1. 曲線 microforceps 門脈右枝を公開する腹膜と一緒に頭側動脈を引き出します。
    2. 前のカットで右後頭葉支店 6-0 シルク ネクタイを縛る。右後葉は目に見えて青ざめてポータル静脈を結紮後。
    3. 旋回中の抵抗に対して推進を避けるため、動脈や門脈をテアリングを防ぐため。出血の場合滅菌綿棒で少なくとも 1 分間圧力を適用し、次に見直します。出血が停止しない場合は、動物を犠牲します。
  5. (私の人生の愛) (LLL) 横方向の左と左の中央葉を縛る枝。これらの枝は、1 つの一般的なトランクを持っています。(図 3)。左の中央葉支店は、LLL の実質内門脈から発生します。
    1. カット済み 6-0 シルク ネクタイを使用して私のライフ支店 LLL 両方と愛につながる門脈を縛る。
    2. LLL につながる動脈に損傷を避けるため、腹膜の層内で実行している私の人生を愛する。腹膜慎重に戻って皮をむき、限り、彼らはそのまま滞在します。私の人生に目に見えて LLL と愛薄い枝を結紮後。
  6. 尾状葉枝 (図 3) を縛る。ラットにおける別の尾状葉をややにつながる門脈脱ぐ、門脈から遠位方向と内側右葉枝の主要な門脈からの離陸 (厳密に下方にない人間や大きな動物のように)。
    1. それを分析し、腹膜と胆管、門脈から動脈を持ち上げて、それを取り囲みます。
    2. 横方向から来る曲線 microforceps と尾状葉の門脈枝を取り囲みます。尾状突起が二つ目に見えて青く尾状葉枝は 6-0 絹糸を結紮後。
  7. 右と左の中央葉の間明確な分界線によって表示される右手正中葉 (RML) の排他的な門脈血流につながるこれらの 3 つの門脈の枝を結ぶこと。

4. 門脈結紮離断 (PVL + T) と

  1. RML 間の分界のラインに沿って切除を行い、PVL (図 3 D) 後の人生が大好き。
  2. Precauterize 肝組織の分界線に沿って 1 mm 熱傷ストリップを作成するのに非常に細かい脳神経外科先端非付着バイポーラ銀鉗子を使用します。
  3. 慎重に precauterized 組織を切断するのにハサミを使用します。かなり、断裂の深さを適切に評価することは困難です。目標は、ラットの intrahepatically を実行する、可能な限り上大静脈に近くなることです。下大静脈の損傷は、することができます通常、停止しては広範な出血を伴うです。
  4. 傷害の場合、綿棒を使用して穏やかな圧力を適用が 3-4 分以内で出血が停止しない場合犠牲動物。縫合糸を使用して上大静脈を修復の試み一般に成功していません。ラットは、空気栓塞を機会に発生し、心停止につながる可能性がありますに非常に敏感です。

5. 術中門脈圧と流量の

  1. 圧モニター (図 4 a) に接続されている G30 針で直接穿刺して門脈圧を評価します。
  2. 2 mm のボリューム フロー プローブが横方向に配置使用はポータル流量以上 2 分 (図 4 b) の直接計測フロー デバイスに接続。安定した測定品質マシンのディスプレイに示されているレコード データのみ。
  3. すなわち3 つの門脈枝またはオフに 3 つの門脈枝を結ぶと実質の断裂を実行するオフを結ぶそれぞれのプロシージャを定義するステップのグループの後、門脈血流量と圧力を別々 に評価します。RML と愛私の人生。

6. 最後の外科の手順

  1. 閉じる前に腹腔内で小腸が正しく配置されていることを確認します。
  2. SH 1 針で腹膜と腹壁縫合糸 3-0 シルクを閉じます。
  3. 最後にマクソン 5-0 を使用して皮膚を縫合します。
  4. もう一度お肌を消毒します。
  5. 再度適用生理食塩水 5 mL 皮下皮下組織の横に、腹部に。

7 小さな動物の CT を用いたラット肝超高速

  1. 最初の ct の前に 24 h は、G26 静脈内カテーテルを尾静脈に造影剤の 200 μ L を挿入します。
  2. マイクロ CT を使用すると、ラットをスキャンします。全身麻酔を誘導するためにプレキシ グラス箱に動物を配置 (30 5 vol % で最初フラッシュ s、動物は麻酔下で、配管システムを介してスキャンを通してそれを維持するまで 2-3 vol % のイソフルラン麻酔濃度が続く)。最適な画像品質のためには、動物の呼吸と CT スキャンを同期します。
  3. デジタル画像と通信医学 (DICOM) ファイルをエクスポートし、イメージング プラットフォーム OsiriX 8.0 パブリック ドメインを使用して分析します。肝臓でナノ粒子のコントラストの radiodensitiy に基づく葉罫線 (Schaddeらの図 2 aを参照してください部分的な肝の体積を計算する利益 (率 ROI) メニューの地域を使用して"閉じた多角形「ツールを使用します。17)
  4. 標準モデルで 3 日間を成長し、ボリュームの増加を評価するために CT スキャンを得る毎日肝臓を許可します。

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結果

2 つの異なる手術門脈結紮 (PVL) と明らかに異なる成長カイネティクスの断裂 (PVL + T) 結果に PVL。PVL PVL + T ではるかに大きい中央右葉 (RML) ができるに対し、3 日以内の適度なボリュームの増加を誘導する (図 5) を見た。これは、毎日の超高速で検証できます。それは PVL + t.17でトリプル中に PVL で 3 日以内、RML の量が約 2 倍します。

門脈内流量測定、PLV とまた PVL + T の減少の流れにもかかわらず、安定した流れを明らかにする (Schaddeらの図 3 aを参照してください。17). 全体の門脈血流量が原因となり、「ポータル hyperflow"以前...

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ディスカッション

このプロトコルは ALPPS の動物モデルの PVL + T、約 2 倍の PVL 単独と比較して 3 日以内のボリュームの増加による、急激な肥大を呈する。17で図 1に示すように、中間の肝はその左側と右側に 2 つの独立したポータルの静脈によって提供される 1 つの連続した実質の質量ので右中肝、肝成長モデル葉として使用は最近、公開された作品。17は、他のレポートと比較して、モデルはいくつかの利点を提供しています。解剖学的, 中葉の最高の選択は、断裂とそれにより担保の流れの閉塞をことができます 1 つの連続した実質の質量として人間の肝臓を表します。左中央葉の門脈枝の分岐 (私の人生を愛する) 私の人生と LLL の愛の結合された結紮の左葉外側 (LLL) 内できます。

様々 なラットがあった、1 つのマウス ALPPS モデル開発し、説明。18多くのラットのモデル

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者の謝辞があります。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
イソフルラン、250 mLボトルAttane, Piramal, Mumbai, IndiaLDNI 22098標準獣医用機器
Tec-3 イソフルオラン気化器Ohmeda, GE-Healthcare, Chicago, ILもう利用できません標準的な獣医用機器 
Buprenorphine (Temgesic)Indivior、バール、スイス7680419310353GTIN-number
Vitamine 軟膏Bausch&Lomp, Zug, Switzerland7680223980247GTIN-number
Atropine sulfate 0.5 mg/mLSintetica SA, Mendrisio, Switzerland7680565330045GTIN-number
Microsurgery microscopeOlympus, Tokio, JapanSZX10Standard vet. equipment
BetadineMundipharma, Basel, Switzerland7680342821377GTIN-number
SpongesCarl RothGmbH、カールスルーエ、ドイツNK83.1ミニスポンジ
腹部壁リトラクターN/AN/AペーパークリップとQ-Tips
3-0シルクからエチコン、ニュージャージー州サマービルK872H標準外科用
ハサミ ワールド精密機器(WPI)、サラソタ、フロリダ州 503371標準マイクロサージェリー
アドソン鉗子ワールドプレシジョンインスツルメンツ(WPI)、サラソタ、フロリダ州501244-G標準マイクロサージェクティブ
ファインチップマイクロ鉗子ワールド精密インスツルメンツ(WPI)、サラソタ、フロリダ州501976チップは定期的に磨く必要があります
湾曲したファインチップマイクロ鉗子ワールド精密インスツルメンツ(WPI)、サラソタ、フロリダ州504513ポータル静脈の枝を回るために不可欠です 
6-0 LOOKブラック編組シルクサージカルスペクタリティーズコーポレーション、ワイオミッシング、ペンシルバニア州 SP114スプール、施術前にプレカット
2-0 シルク縫合糸Ethicon, Sommerville, NJK833標準外科
用 5-0 マクソン縫合糸Covidien, ダブリン, アイルランド6608-21標準外科
用バイポーラマイクロ鉗子Sutter, Freiburg, Germany780148SGS実質離反に必須
Q-tips smallCarl Roth GmbH, Karlsruhe,ドイツEH11.1標準外科
用QチップビッグカールロスGmbH、カールスルーエ、ドイツXL54.1標準外科
G30針 テルモ、東京、日本NN-3013R 標準的な麻酔器具
2 mmボリュームフロープローブ Transonic Systems, Ithaca, NYMA-2PSHAT-311 流量計用の最小のプローブ
Transonic 流量計Transonic Systems, Ithaca, NYHAT-311 Transsonic flow QC meter手術用第 1 世代流量計
ExiTron nano 12,000 Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany130-095-698肝臓と脾臓を不透明にするナノ軟骨造影剤
G26静脈内カテーテルBecton Dickinson, Franklin Lakes, NJ391349標準的な麻酔器具
Quantum FX MicroCT Perkin Elmer, Waltham, MAN/AZü大学生理学研究所の標準的な小動物CTスキャナー。rich
OsiriX 8.0Pixmeo Sarl, ジュネーブ, スイスN/Aパブリックドメインソフトウェア : www.pixmeo.com
自作 

参考文献

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