نقدم بروتوكول لتوصيف الجزيئية البيولوجية قابلة للطي وملزمة التفاعلات مع يغاندس ثيرمولابيلي باستخدام القياس فرق المسح السريع.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
قياس الملامح الجزيئية البيولوجية DSC مع يغاندس ثيرمولابيلي لوصف سرعة قابلة للطي والربط التفاعلات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
فرق المسح القياس (DSC) تقنية قوية للتحديد الكمي لمعلمات دينامي حراري تحكم الجزيئية البيولوجية قابلة للطي والتفاعلات ملزمة. تعتبر هذه المعلومات الحاسمة في تصميم المركبات الدوائية الجديدة. ومع ذلك، العديد من يغاندس فارماسيوتيكالي ذات الصلة غير مستقرة كيميائيا عند درجات الحرارة العالية المستخدمة في التحليلات DSC. وهكذا، قياس التفاعلات ملزم هو التحدي لأن تركيزات يغاندس وتحويلها حرارياً المنتجات المتغيرة باستمرار داخل الخلية مسعر. وهنا، يقدم بروتوكول باستخدام يغاندس ثيرمولابيلي و DSC لسرعة الحصول على المعلومات الحرارية والحركية على الطي والربط، ويجند عمليات التحويل. لقد قدمنا طلبا لدينا طريقة للحمض النووي ابتمر MN4 الذي يربط بين الكوكايين يجند ثيرمولابيلي. استخدام تحليل تركيب عالمية جديدة التي تستأثر بتحويل يجند ثيرمولابيلي، يتم الحصول على مجموعة كاملة من طي ومعلمات الربط من زوج من تجارب DSC. وباﻹضافة إلى ذلك، نعرض أن يمكن الحصول على معدل ثابت للتحويل يجند ثيرمولابيلي مع واحد فقط dataset DSC التكميلية. وترد المبادئ التوجيهية لتحديد وتحليل البيانات من عدة سيناريوهات أكثر تعقيداً، بما في ذلك تجميع بيوموليكولي وطي بطيئة، بطيئة ملزمة والاستنفاد السريع ليجند ثيرمولابيلي لا رجعة فيه.
المقدمة
فرق المسح القياس (DSC) وسيلة قوية كوانتيتاتينج الجزيئية البيولوجية ملزمة وقابلة للطي التفاعلات1،،من23. وتشمل مواطن قوة DSC قدرتها على توضيح ملزمة وقابلة للطي آليات، وأن تسفر عن2،معلمات دينامي حراري المقابلة3. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يؤديها في حل الظروف الفسيولوجية قرب DSC ولا تشترط وسم بيوموليكولي أو يجند، مثلاً، مع فلوروفوريس، وتدور التسميات أو النظائر النووية4. يمسح الصك في درجة الحرارة، وقياس كمية الحرارة المطلوبة لتجريدها في بيوموليكولي في وجود وغياب ليجند. ثيرموجرامس الناتجة عن ذل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد نموذج
- تنقية بيوموليكولي المطلوب13.
ملاحظة: هذا البروتوكول الأغراض التي تم شراؤها الكوكايين-ربط الحمض النووي ابتمر MN4 بعد تبادل ضد 2 من كلوريد الصوديوم م ثلاث مرات تليها ثلاث جولات من المياه باستخدام عامل تصفية الطرد مركزي مع غشاء وقف وزن الجزيئي كاتشين 3. - توليف وتنقية، أو شراء المطلوب يجند ثيرمولابيلي13.
ملاحظة: ربط MN4 الكوكايين يجند ثيرمولابيلي. كما يربط MN4 الكينين، الذي يستخدم كعنصر تحكم سلبية ليجند ثيرمولابيليتي في هذه درجات الحرارة التجريبية. - تجهيز المخازن المؤقتة للغسيل الكلوي بيوموليكولي المنقي وانحلال يغاندس (المخزن كلوريد الصوديوم فوسفات الصوديوم و 140 ملم 20 ملم، و....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وترد بيانات تمثيلية ليجند ثيرمولابيلي DSC في الشكل 1. الموقف وارتفاع ذروة يجند زمنياً ثيرمولابيلي تباعا التحولات إلى أسفل نحو من بيوموليكولي غير منضم كما زف يجند ثيرمولابيلي مع كل عملية مسح (الشكل 1a). يتم استخدام التشكيل الجانبي تمسخ الحرة كمرجع لنقطة النهاية ليجند ثيرمولابيلي التحويل (الشكل 1b). وترد بيانات منضمة إلى الكينين MN4 كعنصر تحكم سلبية ليجند ثيرمولابيلي التحويل (الشكل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
تفاصيل التحليل المناسب العالمية المستخدمة في الشكل 1 و الشكل 2 تم وصف سابقا4. هنا، فإننا مخطط الجوانب العملية لتنفيذ وتحليل تجارب DSC ملزمة مع يغاندس ثيرمولابيلي. ملاحظة الحصول على خط أساس DSC ليجند ثيرمولابيلي وحدها هو طرح من يجند + dataset بيوموليكولي، إلغاء فعالية من الحرارة الإفراج أو استيعابها من قبل التحويل الحراري العملية نفسها. تحليل تركيب العالمية يجن.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
ر. دبليو حاء الخامس أيده ماكغيل العلوم الطبيعية والهندسة بحوث المجلس من كندا (مقدمة) البرنامج التدريبي في بيونانوماتشينيس. أ. م. ك. وب. أ. ج. كانت تدعمها في منح الأموال 327028-09 (أ. ك. م) و 238562 (ب. أ. ج.).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| كلوريد الصوديوم | Chem Impex | # 00829 | |
| فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة ثنائي الهيدرات | Sigma Aldrich | 71502 | |
| فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة | Sigma Aldrich | S9763 | |
| المياه منزوعة السمك للبيولوجيا الجزيئية | Millipore | H20MB1001 | |
| مرشحات حقنة معقمة 0.2 ميكرون | VWR | CA28145-477 | |
| مرشحات طرد مركزي 3 كيلو دالتون | غسيل | الكلى UFC900324 | |
| ميليبور 0.5-1.0 كيلو دالتون | مختبرات الطيف | 131048 | |
| أنابيب السيليكون | VWR | 89068-474 | |
| أغطية شفة DSC البلاستيكية | TA Instruments | 6111 | |
| DNA aptamer MN4 | تقنيات الحمض النووي المتكاملة | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
| الكوكايين | سيجما ألدريتش | C008 | |
| الكينين | سيجما ألدريتش | 22620 | |
| NanoDSC-III مقياس السعرات | الدقيقة TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
| DSCRun software | TA | Instruments http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| برنامج NanoAnalyze | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Contrad-70 | VWR | 89233-152 |
المراجع
- Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design. Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).
- Privalov, P. L., Dragan, A. I.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
