ميكرويرادييشن الليزر أداة مفيدة لإجراء دراسات لإصلاح الحمض النووي في الخلايا الحية. يتم عرض نهج منهجي لاستخدام أشعة الليزر فوق البنفسجية للحث على مختلف الآفات الحمض النووي. ونحن قد الأمثل طريقة ميكرويرادييشن المحلية أن يحافظ على دورة الخلية الطبيعية؛ وهكذا، خلايا المشع المضي قدما من خلال الانقسام.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تقنيات الفحص المجهري [كنفوكل] لدراسة تفاعلات البروتين البروتين وحركية في الحمض النووي آفات متقدمة
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ميكرويرادييشن المحلية مع الليزر يمثل أداة مفيدة للدراسات المتعلقة بالعمليات المتصلة بإصلاح الحمض النووي في الخلايا الحية. وهنا يصف لنا منهجية لتحليل حركية البروتين في الآفات الحمض النووي عبر الوقت أو البروتين-بروتين تفاعلات على الكروماتين ميكرويرادياتيد محلياً. ونحن أيضا إظهار كيفية التعرف على كل مراحل دورة الخلية استخدام نظام الهاتف الخلوي فوكسي لدراسة حركية الخلية-دورة-تعتمد على البروتين في الآفات الحمض النووي. وصف منهجية لاستخدام أشعة الليزر فوق البنفسجية اثنين (355 نانومتر و 405 نانومتر) للحث على أنواع مختلفة من تلف الحمض النووي ويرد أيضا. انتقل من خلال الانقسام عادة فقط ميكرويرادياتيد الخلايا بليزر صمام ثنائي 405 نانومتر وكانت تخلو من سيكلوبوتاني بيريميدين dimers (وثائق). نعرض أيضا كيف يمكن أن تكون ثابتة الخلايا ميكرويرادياتيد في نقطة زمنية معينة لأداء إيمونوديتيكتيون البروتينات الذاتية للفائدة. دراسات إصلاح الحمض النووي، بالإضافة إلى ذلك يمكننا وصف استخدام الأساليب الفيزيائية الحيوية بما في ذلك فراب (Fluorescence الانتعاش بعد فوتوبليتشينج) وفليم (Fluorescence عمر التصوير المجهري) في الخلايا بصورة عفوية تحدث بؤر تلف الحمض النووي. نعرض أيضا طلبا من فليم-الحنق (Fluorescence الرنين الطاقة نقل) في الدراسات التجريبية لتفاعلات البروتين البروتين.
المقدمة
أضرار الحمض النووي يؤدي إلى ظهور آفات الحمض النووي يتألف من سيكلوبوتاني بيريميدين dimers (وثائق البرامج القطرية)، 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine، وحبلا واحد أو مزدوج-حبلا فواصل1،2. أشعة γ هي الشكل الإشعاع المؤين بالطاقة أعلى و penetrance عالية، وبالتالي مصدر هذا الإشعاع يستخدم على نطاق واسع في العلاج الإشعاعي3. من ناحية أخرى، التي يسببها تجريبيا الحمض النووي الأضرار الناجمة عن الأشعة فوق البنفسجية أشعة الليزر يقلد التعرض الطبيعي لضوء الأشعة فوق البنفسجية. ميكرويرادييشن فوق البنفسجية، كطريقة مجهرية، يمثل أداة تجريبية لدراسة أضرار الحمض النووي في الخلايا الحية الفردية. واستخدمت ميكرو....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. "زراعة خطوط الخلايا"
- خطوط الخلايا المستمدة من هيلا
ملاحظة: "هيلا استخدام" خلايا سرطان عنق الرحم: أما خلايا هيلا ستابلي معربا عن هيستون H2B معلم مع الخلايا بروتينات فلورية خضراء أو هيلا فوكسي الإعراب عن طلب تقديم العروض-Cdt1 في G1 والمراحل S الأولى والتجارة والنقل-جيمينين في مراحل S/G2-م ( الشكل 1).- لزراعة جميع خطوط الخلايا المستمدة من الحلة، استخدم دولبيكو ' s تعديل النسر ' s المتوسطة (دميم) تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين والمضادات الحيوية المناسبة في 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد التي تحتوي على 5% CO 2. استبدال متوسط 2-3 مرات في الأسبوع.
- إزالة الثقافة المتوسطة، وش....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل] متقدمة، لاحظنا تراكم البروتينات 53BP1 ومنها مشري مشري معلم في الآفات الحمض النووي. أجريت التحاليل ميكرويرادييشن المحلي للخلايا الحية. أن ندرك أنماط التوزيع النووي من البروتينات ذات الصلة بإصلاح الحمض النووي في مراحل دورة الخلية الفردية، استخدمنا النظام الخلوي فوكسي، التي من الممكن أن تحدد G1, S المبكرة، ومراحل الخلية G2 دورة (الشكل 1). تطبيق البيولوجية من طراز فوكسي الخلوية التي نشرناها في سوشنكوفا et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تقنيات الفحص المجهري تمثل الأدوات الأساسية في مختبرات البحوث. هنا، وصفاً موجزاً للأساليب المستخدمة لدراسة البروتين التوظيف وحركية في الآفات الحمض النووي. لاحظنا خصوصا لدينا الخبرة التجريبية في ميدان ميكرويرادييشن المحلية من الخلايا الحية، ونحن نناقش دراسة حركية البروتين بالتفاعل فراب والبروتين-بروتين في الآفات الحمض النووي بالحنق تبيض يقبلون28 وبه خيارات متقدمة تعديل الحنق-فليم (الشكل 4 أ-د). الأساليب الموضحة هنا أدوات لا غنى عنها لفهم صحيح لعمليات إص.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن أن هناك لا تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل الوكالة المسؤولة عن المنح من الجمهورية التشيكية، ومشروع P302-12-G157. التجارب كانت مدعومة أيضا CZ09 برنامج البحوث النرويجية التشيكية، الذي يشرف على الصناديق النرويجية، ووزارة التربية والتعليم والشباب والرياضة في الجمهورية التشيكية (منح رقم: 7F14369).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <زراعة الخلايا > قوية < / قوية > | |||
| HeLa | ATCC | CCL-2TM | |
| ES-D3 [D3] | ATCC | CRL-11632TM | |
| HeLa -Fucci | |||
| DMEM | PAN-Biotech | P03-0710 | |
| DMEM نسبة عالية من الجلوكوز | سيجما ألدريتش | D6429-500ML | |
| مصل الأبقار الجنينية (FBS) | HyClone | SV30180.03 | |
| ES Cell FBS | Gibco | 16141-079 | |
| الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| mLIF (عامل مثبط سرطان الدم في الفأر) | Merck Millipore | ESG1107 | |
| MTG (1-Thioglycerol) | Sigma-Aldrich | M6145-25ML | |
| محلول البنسلين والستربتومايسين | Biosera | XC-A4122 / 100 | |
| Trypsin - EDTA | Biosera | XC-T1717 / 100 | مخفف مع 1 & مرات ؛ PBS بنسبة 1: 6 |
| أطباق زراعة خلايا Nunclon | Sigma-Aldrich | P7866 | زراعة خلايا mESCs D3 |
| & طبق صغير 35 م + A15: I35m Grid-500 | Ibidi GmbH | 81166 | طبق مجهري |
| 0.2٪ جيلاتين | سيجما ألدريتش | G1890-100G | مخفف في ماء التقطير والتعقيم |
| <قوي>الاسم < / strong> | الشركة< / قوي> | رقم الكتالوج | تعليقات |
| تعداء الخلية | |||
| GFP-p53 البلازميد | Addgene | 12091 | |
| mCherry-PCNA بلازميد | هدية سخية من كريستينا كاردوسو, جامعة Technische ä ر دارمشتات | ||
| mCherry-53BP1 البلازميد | Addgene | 19835 | |
| Metafecetene | Biontex Laboratories GmbH | T020 & ndash ؛ 2.0 | |
| 10 مرات ؛ PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | لاستخدام التعداء 1 ومرات ؛ PBS مخفف في ماء خال من النوكلياز |
| 5-bromo-2'-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | 11296736001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal المجهر | |||
| Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| ليزر الضوء الأبيض | Leica Microsystems | ||
| 355 نانومتر ليزر | Coherent Inc. | طاقة الليزر 80 ميغاواط | |
| 405 نانومتر ليزر | Leica Microsystems | طاقة الليزر 50 ميغاواط | |
| <قوي>الاسم < / قوي > | <قوي> الشركة < / قوي > | <قوي>رقم الكتالوج < / قوي > | < قوي >تعليقات < قوي > |
| < قوي > تلطيخ التألق المناعي < / قوي > | |||
| Coverslip | VWR الدولية المحدودة | 631-1580 | |
| 4٪ بارافورمالدهايد | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Triton X100 | MP Biomedicals | 2194854 | |
| Saponin من لحاء quillaja | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| 53BP1 | Abcam | ab21083 | الجسم |
| المضاد الأساسيAlexaFluore 647 | Thermo Fisher Scientific | A27040 | الجسم المضاد الثانوي |
| Vectashield | Vector Laboratories Ltd | H-1000 | تصاعد المتوسطة |
المراجع
- Cadet, J., Mouret, S., Ravanat, J. L., Douki, T. Photoinduced damage to cellular DNA: direct and photosensitized reactions. Photochem Photobiol. 88 (5), 1048-1065 (2012).
- Cooke, M. S., et al. Immunochemical detection of UV-induced DNA damage and repair.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
![تقنيات الفحص المجهري [كنفوكل] لدراسة تفاعلات البروتين البروتين وحركية في الحمض النووي آفات متقدمة](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F55999.jpg&w=3840&q=75)