Microirradiation láser es una herramienta útil para estudios de reparación del ADN en las células vivas. Se muestra un enfoque metodológico para el uso de láseres de rayos UVA para inducir varias lesiones del ADN. Hemos optimizado un método para microirradiation local que mantiene el ciclo normal de la célula; así, las células irradiadas proceden a través de mitosis.
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Artículo de método
Avanzadas técnicas de Microscopía Confocal para estudiar las interacciones proteína-proteína y cinética en las lesiones del ADN
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Resumen
Resumen
Microirradiation local con láser representa una herramienta útil para estudios de procesos relacionados con la reparación de DNA en células vivas. Aquí, describimos un enfoque metodológico para el análisis de la cinética de la proteína en las lesiones del ADN sobre interacciones proteína-proteína o tiempo en localmente microirradiated cromatina. También nos enseña a reconocer las fases individuales del ciclo celular utilizando el sistema celular Fucci para estudiar la cinética de la proteína dependiente de ciclo celular en las lesiones del ADN. Una descripción metodológica de la utilización de dos láseres UV (355 nanómetro y 405 nm) inducir diferentes tipos de daño de la DNA también se presenta. Sólo el microirradiated de las células por el láser de 405 nm diodo procedió normalmente a través de la mitosis y se desprovisto de dímeros de pirimidina ciclobutano (CPDs). También mostramos cómo las células de microirradiated pueden ser fijo en un momento dado para llevar a cabo la inmunodetección de proteínas endógenas de interés. Para los estudios de reparación de ADN, además se describe el uso de métodos biofísicos como FRAP (recuperación de fluorescencia Tras Fotoblanqueo) FLIM (vida proyección de imagen de microscopía de fluorescencia) en las células con que se producen espontáneamente focos de daño de ADN. También se muestra una aplicación de FLIM-FRET (energía de resonancia de la fluorescencia transferencia) en los estudios experimentales de las interacciones proteína-proteína.
Introducción
Daños en el ADN conduce a la aparición de las lesiones del ADN de dímeros de pirimidina ciclobutano (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine y sola o doble cadena rompe1,2. Los rayos γ son la forma de radiaciones ionizantes con la más alta energía y alta penetrancia, así esta fuente de radiación es ampliamente utilizada en radioterapia3. Por otro lado, experimentalmente inducida por daño en el ADN causada por lásers imitadores naturales la exposición Ultravioleta a los rayos UV. Microirradiation UVA, como un método microscópico, representa una herramienta experimental para el estudio....
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Protocolo
1. cultivo de líneas celulares
- líneas de células HeLa
Nota: las células del carcinoma cervical HeLa uso: ya sea células HeLa expresando estable histona H2B etiquetadas con GFP o Fucci HeLa células expresando RFP Cdt1 en el G1 y fases iniciales de S y GFP-geminin en las fases S/G2-M ( figura 1).- Para el cultivo de todas las líneas de células HeLa, utilizar Dulbecco ' s modificado Eagle ' medio de s (DMEM) suplementado con 10% suero fetal bovino y antibióticos apropiados a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% CO 2. Reemplazar el medio 2 - 3 veces por semana.
- Qui....
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Resultados
Utilizando microscopía confocal avanzada, se observó una acumulación de proteínas 53BP1 y PCNA mCherry mCherry etiquetadas en las lesiones del ADN. Se realizaron análisis por microirradiation local de las células vivas. Para reconocer los patrones de distribución nuclear de proteínas relacionadas con la reparación de ADN en cada ciclo celular fases, hemos utilizado el sistema celular Fucci, por la que es posible determinar la G1, S temprano, y las fases G2 de la célula (
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Discusión
Técnicas de microscopía representan herramientas básicas en laboratorios de investigación. Aquí, una breve descripción de los métodos utilizados para el estudio de reclutamiento de la proteína y se presenta la cinética en las lesiones del ADN. Destaca especialmente la experiencia experimental en el campo de la microirradiation local de las células vivas, y discutimos el estudio de la cinética de la proteína por interacción proteína-proteína y FRAP en las lesiones del ADN por blanqueo de aceptador traste.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no hay ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Agencia de donación de la República Checa, proyecto P302-12-G157. Los experimentos también fueron apoyados por la CZ09 de programa de investigación Checa-Noruega, que es supervisado por los fondos noruegos y por el Ministerio de educación, juventud y deporte de la República Checa (número: 7F14369).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| células fuertes | |||
| HeLa | ATCC | CCL-2TM | |
| ES-D3 [D3] | ATCC | CRL-11632TM | |
| HeLa -Fucci células | http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html | ||
| DMEM | PAN-Biotech | P03-0710 | |
| DMEM alta glucosa | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | |
| Suero fetal bovino (FBS) | HyClone | SV30180.03 | |
| ES Cell | FBS Gibco | 16141-079 | |
| Aminoácidos no esenciales (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| mLIF (factor inhibidor de la leucemia en ratones) | Merck Millipore | ESG1107 | |
| MTG (1-tioglicerol) | Sigma-Aldrich | M6145-25ML | |
| Solución de Penicilina-Estreptomicina | Biosera | XC-A4122/100 | |
| Tripsina - EDTA | Biosera | XC-T1717/100 | diluido con 1 × PBS en proporción 1:6 |
| Placas de cultivo celular Nunclon | Sigma-Aldrich | P7866 | cultivo de mESCs células D3 |
| µ-Plato 35m+A15:I35m Grid-500 | Ibidi GmbH | 81166 | placa microscópica |
| 0,2% Gelatina | Sigma-Aldrich | G1890-100G | diluida en agua destilada y autoclave |
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comments |
| Cell transfection | |||
| GFP-p53 plásmido | Addgene | 12091 | |
| mCherry-PCNA plásmido | generoso regalo de Cristina Cardoso, Technische Universitä t Darmstadt | ||
| mCherry-53BP1 plásmido | Addgene | 19835 | |
| Metafeceteno | Biontex Laboratories GmbH | T020– 2.0 | |
| 10 y veces; PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | para uso en transfección 1 y veces; PBS diluido en agua libre de nucleasas |
| 5-bromo-2'-desoxi-uridina | Sigma-Aldrich | 11296736001 | |
| Name | Company | Número de catálogo | Comments |
| >Confocal Microscopcopy | |||
| Leica TCS SP5 | Microscopio Leica Microsystems | ||
| Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Láser de luz blanca | Leica Microsystems | ||
| Láser de 355 nm | Coherent Inc. | potencia del láser 80 mW | |
| Láser de 405 nm Potencia | Leica Microsystems | 50 mW | |
| Nombre | Company | Número de catálogo | Comentarios |
| >Immunofluorescence staining | |||
| Coverslip | VWR International Ltd | 631-1580 | |
| 4% paraformaldehído | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Triton X100 | MP Biomedicals | 2194854 | |
| Saponina de corteza de quillaja | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| 53BP1 | Abcam | ab21083 | anticuerpo |
| primarioAlexaFluore 647 | Thermo Fisher Scientific | A27040 | anticuerpo secundario |
| Vectashield | Vector Laboratories Ltd | H-1000 | medio de montaje |
Referencias
- Cadet, J., Mouret, S., Ravanat, J. L., Douki, T. Photoinduced damage to cellular DNA: direct and photosensitized reactions. Photochem Photobiol. 88 (5), 1048-1065 (2012).
- Cooke, M. S., et al. Immunochemical detection of UV-induced DNA damage and repair.
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