Application de la pincée de patch automatisée guidée par image pour l'étude des neurones dans les tranches de cerveau

Résumé

Ce protocole décrit comment mener des expériences automatiques de fixation de patch guidées par image à l'aide d'un système récemment développé pour un équipement d'électrophysiologie standard in vitro .

Résumé

La pince à blocs de cellules entières est la méthode standard d'or pour mesurer les propriétés électriques des cellules individuelles. Cependant, la pince de patch in vitro reste une technique difficile et à faible débit en raison de sa complexité et de sa grande dépendance vis-à-vis du fonctionnement et du contrôle de l'utilisateur. Ce manuscrit démontre un système de pincement de patch automatique guidé par image pour des expériences in vitro de patch clamp de cellules entières dans des tranches de cerveau aiguë. Notre système met en œuvre un algorithme basé sur la vision par ordinateur pour détecter les cellules marquées par fluorescence et pour les cibler pour une correction entièrement automatique à l'aide d'un micromanipulateur et d'un contrôle interne de la pression de la pipette. L'ensemble du processus est hautement automatisé, avec des exigences minimales pour l'intervention humaine. Les informations expérimentales en temps réel, y compris la résistance électrique et la pression interne de la pipette, sont documentées électroniquement pour des analyses futures et pour l'optimisation de différents types de cellules. Bien que notre système soit décrit dans le contexte du brai aiguN enregistrements de tranche, il peut également être appliqué à la pince de correction automatisée guidée par l'image des neurones dissociés, des cultures de tranches organotypiques et d'autres types de cellules non neuronales.

Introduction

La technique de pincement de patch a été développée pour la première fois par Neher et Sakmann dans les années 1970 pour étudier les canaux ioniques des membranes excitables ¹ . Depuis lors, le serrage des patchs a été appliqué à l'étude de nombreux sujets différents au niveau cellulaire, synaptique et de circuit - in vitro et in vivo - dans de nombreux types de cellules différentes, y compris les neurones, les cardiomyocytes, les ovocytes Xenopus et les liposomes artificiels ² . Ce processus implique l'identification correcte et le ciblage d'une cellule d'intérêt, un contrôle complexe ....

Protocole

1. Configuration du système

1. Construire l'unité de contrôle de la pression.
   1. Assembler l'unité de commande de pression en fonction de la carte de circuit ( Figure 1 ). Souder les pièces nécessaires sur la carte de circuit imprimé (PCB) fabriquée selon les schémas de circuit électrique ( figure 1b ). Utilisez des résistances standard, des diodes électroluminescentes, des transistors à effet de champ à semi-conducteurs en métal-oxyde (MOSFET), des condensateurs et des connecteurs (voir la table des matières ). Electrovannes à souder sur la PCB. Connectez la pompe à ai....

Résultats

Notre système a été testé sur sa capacité à réparer les cellules dans des tranches de cerveau aiguë, des cellules souches pluripotentes induites par la souris (iPSC) différenciées en neurones et des cellules HEK 293 exprimant artificiellement des canaux d'intérêt. La figure 3 montre une expérience utilisant des souris transgéniques Thy1-ChR2-YFP (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J) ciblant les neurones pyramidaux de la couche 5 marquée par fluo.......

Discussion

Ici, nous décrivons une méthode pour les enregistrements automatiques de pince à patchs guidés par image in vitro . Les étapes clés de ce processus sont résumées comme suit. Tout d'abord, la vision par ordinateur est utilisée pour reconnaître automatiquement la pointe de la pipette à l'aide d'une série d'images acquises au microscope. Cette information est ensuite utilisée pour calculer la fonction de transformation de coordonnées entre le microscope et les systèmes de coordonnées du manipulateu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Caméra CCD	QImaging Rolera	Bolt
Plate-forme d’électrophysiologie	Scientifica	SliceScope Pro 2000	Comprend microscope et manipulateurs. Le logiciel de contrôle du manipulateur fourni par le fabricant et démontré dans ce manuscrit est « Linlab2".
Amplificateur	Dispositifs moléculaires	MultiClamp 700B	Amplificateur à microélectrodes contrôlé par ordinateur
Numériseur	Dispositifs moléculaires	Axon Digidata 1550
Source lumineuse LED	Cool LED	pE-100	488 nm Longueur d’onde 488 nm
Carte d’acquisition de données	Mesure Calcul	USB1208-FS	Secondaire DAQ. Voir le manuel à l’adresse : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf
Électrovannes	The Lee Co.
Pompe à air	Industrie virtuelle	VMP1625MX-12-90-CH
Capteur de pression d’air	Semi-conducteur Freescale	MPXV7025G
Holding Slice Hold-down	Warner instruments	64-1415 (SHD-40/2)	Kit d’ancrage Slice, plat pour chambre RC-40, 2,0 mm, 19,7 mm
Python	Anaconda	version 2.7 (32 bits pour Windows)	https://www.continuum.io/downloads
Bornes à vis	Sparkfun	PRT - 08084	Bornes à vis Pas de 3,5 mm (2 broches)
(2 broches)
MOSFET à canal N 60 V 30 A	Sparkfun	COM - 10213
Douilles DIP Queue à souder - 8 broches	Sparkfun	PRT-07937
LED - Rouge de base 5 mm	Sparkfun	COM-09590
LED - Basic Green 5mm	Sparkfun	COM-09592
Barrel Power Jack/Connector (SMD)	Sparkfun	PRT-12748
Adaptateur mural Alimentation - 12 V DC 600 mA	Sparkfun	TOL-09442
Fil de raccordement - Assortiment (Solid Core, 22 AWG)	Sparkfun	PRT-11367
Verrouillage Mâle x Femelle x Femelle Robinet d’arrêt	ARK-PLAS	RCX10-GP0
Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Tubes flexibles	Fisher scientific	14-171-129	Diamètre extérieur : 1/8 po Diamètre intérieur : 1/16 po.
Câble coaxial BNC mâle vers BNC mâle	Belkin Components	F3K101-06-E
Résistance 560 Ohm (tolérance de 5 %)	Radioshack	2711116
Picospritzer	General Valve	Picospritzer II

LHDA0531115H DC