Здесь мы представляем протокол захвата сигналов, примененный к протопластам листьев Arabidopsis thaliana leaf mesophyll. Этот метод критически полагается на ультрафиолетовое сшивание in vivo и позволяет изолировать и идентифицировать растительные мРНК-связывающие белки из физиологической среды.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Взаимодействие с мРНК из протопластов растений
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
РНК-связывающие белки (RBPs) определяют судьбы РНК. Они участвуют во всех путях биогенеза РНК и особенно вносят свой вклад в посттранскрипционную регуляцию генов (ПГРР) мессианных РНК (мРНК). В последние несколько лет ряд связанных с мРНК протеомами из клеточных линий дрожжей и млекопитающих успешно изолировали с помощью нового метода, называемого «захват млекопитающих мРНК», который позволяет идентифицировать мРНК-связывающие белки (mRBP) Непосредственно из физиологической среды. Метод состоит из ультрафиолетового (УФ) сшивки in vivo , вытягивания и очистки комплексов рибонуклеопротеинов мессенджера (mRNPs) гранулами олиго (dT) и последующей идентификации сшитых белков с помощью масс-спектрометрии (MS). Совсем недавно, применяя тот же метод, сообщалось о нескольких растительных мРНК-связанных протеомах из разных источников ткани Arabidopsis : этиолированные проростки, ткань листьев,Протопласты листьев мезофилла и культивируемые корневые клетки. Здесь мы представляем оптимизированный метод захвата мРНК-методом для протопластов листьев Arabidopsis thaliana leafes, тип клеток, который служит универсальным инструментом для экспериментов, которые включают в себя различные клеточные анализы. Условия для оптимального выхода белка включают количество исходной ткани и продолжительность УФ-облучения. В мРНК-связанном протеоме, полученном из среднемасштабного эксперимента (10 7 клеток), обнаружены RBP, отмеченные наличием РНК-связывающей способности, и были идентифицированы многие новые RBP. Эксперимент может быть увеличен (10 9 клеток), и оптимизированный метод может быть применен к другим типам растительных клеток и видам, чтобы широко изолировать, каталогизировать и сравнивать связанные с мРНК протеомы в растениях.
Введение
Эукариоты используют множественные регуляторные пути биогенеза РНК для поддержания клеточных биологических процессов. Среди известных типов РНК мРНК очень разнообразна и обладает кодирующей способностью белков и их изоформ 1. Путь ПТРГ направляет судьбы пре-мРНК 2 , 3 . RBP из разных семейств генов контролируют регуляцию РНК, а в PTGR специфические mRBPs направляют мРНК через прямые физические взаимодействия, образуя функциональные mRNP. Таким образом, идентификация и характеристика mRBPs и их mRNPs имеет решающее значение для понимания регуляции метаболизма клеточной мРНК
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Изоляция протопластов листьев Arabidopsis Leaf
ПРИМЕЧАНИЕ. Протопласты листьев мезофилла листа Arabidopsis по существу изолированы, как описано Yoo et al ., 2007, с несколькими модификациями 40 .
- Рост растений
- Замачивайте приблизительно 200 семян экотипа Arabidopsis thaliana Col-0 в стерилизованной воде в течение 2 дней при 4 ° C в темноте для расслоения.
ПРИМЕЧАНИЕ. Этого количества семян достаточно для одного образца без CL и одного образца CL (см. Шаг 1.3). - Приготовить горшки с 50% ( об. / Об. ) Смесью почвы и в....
- Замачивайте приблизительно 200 семян экотипа Arabidopsis thaliana Col-0 в стерилизованной воде в течение 2 дней при 4 ° C в темноте для расслоения.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мы наблюдали характерный ореол, который окружает гранулу шарика в образце CL, на этапе 4 промывки промывным буфером 2 ( фиг.1В ). Хотя это и не исследовалось, это явление, вероятно, можно объяснить интерференцией сшитых комплексов mRNP с агрегацией шариков во время магнитного захвата, вызывая образование более диффузного заполнителя. Это указывает на то, что захват олиго-d (T) 25 был эффективным 14 .
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы успешно применили захват мРНК-взаимодействий, разработанный для дрожжей и человеческих клеток, для протопластов листьев мезофилла. Листовые мезофильные клетки являются основным типом молочной ткани листьев растений. Основным преимуществом этого метода является то, что он использует сшивание in vivo для обнаружения белков из физиологической среды.
В этом протоколе мы в основном представляем ряд оптимизированных условий эксперимента ( например, количество протопластов для .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы признаем лабораторию профессора Джориса Уиндикера, который предоставил УФ-сшивающее устройство, оснащенное обычной УФ-лампой. KG поддерживается исследовательским фондом KU Leuven и подтверждает поддержку гранта FWO G065713N.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>РЕАГЕНТЫ | |||
| 0,8 М Маннитол | Сигма | M1902-500G | Первичный изотонический фермент раствор и MMg раствор |
| 2 М KCl | MERCK | Art. 4935 | Первичный изотонический раствор фермента & W5 буфер |
| 0,2 M MES (pH 5,7) (4-морфолинеэтансульфоновая кислота) | Sigma-aldrich | M2933 | Первичный раствор изотонического фермента, W5 буфер и MMg раствор, Фильтрация стерилизация |
| Cellulase R10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | ЦЕЛЛЮЛАЗА » ОНОДЗУКА» R-10, 10 г | Конечный раствор изотонического фермента |
| Macerozyme R10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | MACEROZYME R-10, 10 г | Конечный раствор изотонического фермента |
| 10% (w/v) BSA (бычий сывороточный альбумин) | Sigma-aldrich | A7906-100G | Конечный раствор изотонического фермента & Фильтрационная стерилизация |
| 1 M CaCl2 | Chem-Lab NV | CL00.0317.1000 | Конечный раствор изотонического фермента, W5 буфер и Буфер для разложения |
| 1 M NaCl | Fisher Chemical | S/3160/60 | W5 буфер |
| 2 M MgCl2 | Sigma | M8266-100G | MMg раствор |
| 1 M LiCl (хлорид лития) | Acros | 199885000 | Лизис/связывающий буфер, Промывочный буфер 1, Промывочный буфер 2 & Буфер с низким содержанием соли |
| 5% (w/v) LiDS (додецилсульфат лития) | Sigma-aldrich | L4632-25G | Лизис/связывающий буфер, Буфер для промывки 1 & Фильтрационная стерилизация |
| 1 M DTT (Dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific Промывочный буфер 1 & Промывочный буфер 2 | 307866 | лизис/связывающий буфер,1 |
| M Tris-HCl (pH 7,5) (Tris(hydroxymethyl)аминометан, соляная кислота S.G. (HCl)) | Acros & Fisher Chemical | 167620010 & H/1200/PB15 | Лизис/связывающий буфер, Промывочный буфер 1, Промывочный буфер 2, Буфер с низким содержанием солей и Буфер для элюирования |
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) (этилендиаминтетрауксусная кислота) | Sigma-aldrich | ED-500G | Лизис/связывающий буфер, Буфер для промывки 1, Буфер для промывки 2, Буфер с низким содержанием солей и Элюирующий буфер |
| Tween 20 | MERCK | 8.22184.0500 | Регенерация гранул олиго-d(T)25 |
| 0,1 M NaOH | VWR PROLABO CHEMICALS | 28244.295 | Регенерация гранул олиго-d(T)25 |
| 1x PBS (pH 7,4) (фосфатно-солевой буфер) содержащий (NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4) | Fisher Chemical, MERCK, Sigma-aldrich & SAFC | S/3160/60, Art. 4935, 71640-250G & 60230 | Регенерация олиго-d(T)<суб>25 |
| Раствор протеиназы К (2 μ g/μ L) | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | переваривания белка |
| Invitrogen | LC5925 | SDS-PAGE | |
| qPCR master mix | Promega | A6001 | qRT-PCR анализ |
| РНКазный коктейль | Thermo Fisher Scientific | AM2286 | РНК расщепление |
| Метанол | Sigma-aldrich | 322415 | Фиксация геля и удаление |
| Уксусная кислота | Sigma-aldrich | 537020 | Фиксация геля и гелевая фиксация |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Thermo Fisher Scientific | 20278 | Окрашивание гелем |
| 1 M NH4HCO3 (бикарбонат аммония) | Sigma-aldrich | 09830-500G | Гель для увлажнения и увлажнения Буфер для пищеварения |
| CH3CN (Ацетонитрил) | Sigma-aldrich | 34851-100ML | Гель для обезвоживания и обезвоживания Раствор для растворения пептидов |
| IAA (Йодоуксусная кислота) | Sigma-aldrich | I4386-10G | Алкилирующий агент |
| TFA (Трифторуксусная кислота) | Sigma-aldrich | 302031-10X1ML | Растворитель пептидов |
| FA (Муравьиная кислота) | Sigma-aldrich | 06554-5G Раствор | экстракции пептидов |
| (6 нг/&м; L) | Promega | V5280 | Буфер для сбраживания |
| Название< | strong>Company | Номер в каталоге | Комментарии |
| EQUIPMENT | |||
| Soil | Peltracom | LP2D | Растительный рост |
| вермикулит 3 | Sibli AS | 05VERMICULIET | Чашка |
| Петри для роста растений (150 x 20 мм) | Sarstedt | 82.1184.500 | Носитель для суспензии протопластов |
| 0,22 μ m фильтр | Millipore | SE2M229104 | Гомогенизация конечного изотонического ферментного раствора |
| Razorblade | Agar Scientific | T585 | Rosette leaf strips |
| 35-75 μ м нейлоновая сетка | SEFAR NITEX | 74010 | Протопласт суспензионный фильтр |
| 50 мл круглодонные трубки | Sigma-aldrich | T1918-10EA | Носитель для суспензии протопластов |
| Гемоцитометр<бр/> (Bü | MARIENFELD | 650030 | |
| УФ-сшивающий <аппарат для подсчета клеток Protoplast (>HL-2000 HybriLinker) | UVP, LLC | UVP95003101 | in vivo УФ-сшивающий |
| УФ-лампа (Sankyo-Denki G8T5) | SANKYO DENKI | SD G8T5 | in vivo УФ-сшивающий |
| стеклянный шприц 50 мл | FORTUNA Optima | Z314560 | Гомогенизация лизата протопластов |
| Узкая игла (0,9 x 25 мм) | Becton Dickinson microlance 3 | 2021-04 | Гомогенизация лизата протопластов |
| Rotator Model L26 | Labinco BV | 26110912 | Инкубация образцов путем вращения |
| Oligo-d(T)25 магнитных шариков (5 мг/мл) | New England BioLabs | S1419S | mRNP и связывание мРНК и pull-down |
| Магнитный штатив | Invitrogen | CS15000 | связывание и опускание mРНК и опускание |
| Центробежные фильтрующие блоки (центробежные фильтрующие блоки Amicon Ultra-4) | EMD Millipore | UFC800308 | концентрация mRBP |
| Pierce Silver Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | 24612 | с окрашиванием серебром |
(InviTrap Spin Plant RNA Мини-набор) | Спектрофотометр для очистки молекулярных | 1064100300 | РНК |
| STRATEC (спектрофотометр NanoDrop 1000) | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | Циклер качества и количества РНК |
| в реальном времени (StepOne Real-Time PCR cycler) | Thermo Fisher Scientific | 4376600 | количественное определение кДНК |
| микроколонки C18 (Millipore Zip Tip & micro;-C18 колонки) | Sigma-aldrich | 720046-960EA | очистки пептидов |
(Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer) | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | Масс-спектрометрия на основе протеомики |
| Прибор для жидкостной хроматографии (Ultimate 3000 ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC)) | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | Протеомика на основе масс-спектрометрии |
| C18 колонка (колонка Easy Spray Pepmap RSLC C18) | Thermo Fisher Scientific | ES800 | Масс-спектрометрическая протеомика |
| C18 предварительная колонка (предварительная колонка Acclaim Pepmap 100 C18) | Thermo Fisher Scientific | 160321 | Протеомика на основе масс-спектрометрии |
| Name | Company | Номер в каталоге< | strong>Comments |
| Праймеры для анализа qRT-PCR | Sequences> | ||
| UBQ10 мРНК (Li et al., 2014) | Fw: AACTTTGGTGGTGTTTTTTTTTGG Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAGAGATAA | ||
| 18S рРНК (Durut et al., 2014) | Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG Rv: CACGACCCGGCCAATTA |
Ссылки
- Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 533-544 (2015).
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
