هنا، نقدم مقايسة موثوقة وسهلة لقياس محتوى الجليكوجين في الخلايا السيانوباكتريال. الإجراء ينطوي على هطول الأمطار، اختيار البلمرة، والكشف عن بقايا الجلوكوز. هذا الأسلوب هو مناسبة لكل من ويلديب والسلالات المعدلة وراثيا ويمكن أن تسهل الهندسة الأيضية من البكتيريا الزرقاء.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحديد محتوى الجليكوجين في البكتيريا الزرقاء
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
البكتيريا الزرقاء تتراكم الجليكوجين كخلايا رئيسية داخل الخلايا وتخزين الطاقة أثناء عملية التمثيل الضوئي. وقد أبرزت التطورات الأخيرة في مجال البحوث آليات معقدة من استقلاب الجليكوجين، بما في ذلك دورة بيل من التخليق الحيوي والهدم، وتنظيم الأكسدة، ومشاركة الحمض النووي الريبي غير الترميز. وفي الوقت نفسه، تبذل جهود لإعادة توجيه الكربون من الجليكوجين إلى المنتجات المرغوبة في البكتيريا الزرقاء المعدلة وراثيا لتعزيز غلة المنتج. وتستخدم عدة طرق لتحديد محتويات الجليكوجين في البكتيريا الزرقاء، مع دقة متغيرة والتعقيدات التقنية. هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصل لتحديد موثوق من محتوى الجليكوجين في البكتيريا الزرقاء التي يمكن أن يؤديها في مختبر علوم الحياة القياسية. بروتوكول ينطوي على هطول الأمطار انتقائية من الجليكوجين من المحللة الخلية والبوليمرية إنزيمية من الجليكوجين لتوليد مونومرات الجلوكوز، والتي يتم الكشف عنها من قبل الثور الجلوكوزإديس-بيروكسيديز (الله-بود) انزيم يقترن الفحص. تم تطبيق هذه الطريقة على سينكوسيستيس سب. يك 6803 و سينيكوكوكوس سب. يك 7002، نوعين من الأنواع السيانوباكتريال التي تستخدم على نطاق واسع في الهندسة الأيضية. وعلاوة على ذلك، أظهرت الطريقة بنجاح الاختلافات في محتويات الجليكوجين بين ويلديب والمسوخ المعيبة في العناصر التنظيمية أو الجينات الجينية الجليكوجين.
المقدمة
البكتيريا الزرقاء تراكم الجليكوجين كمخزن الكربوهيدرات كبير من الكربون CO 2 من الثابت في الضوء من خلال عملية التمثيل الضوئي. الجليكوجين هو غليكان يتكون من الخطي α-1،4 مرتبطة الجلوكان مع الفروع التي تم إنشاؤها من قبل روابط α-1،6 مرتبطة الجلوكوزيل. الجليكوجين الحيوي في البكتيريا الزرقاء يبدأ مع تحويل الجلوكوز 6-الفوسفات إلى أدب الجلوكوز من خلال العمل المتسلسل من فسفوغلوكوموتاس و أدب الجلوكوز بيروفوسفوريلاز. يتم نقل شدة الجلوكوز في أدب الجلوكوز إلى نهاية غير الحد من العمود الفقري α-1،4-غلوكان من الجليكوجين من قبل واحد أو أكثر من سينثاسيس الجليكوجين (غلغا). في وقت لاحق، إنزيمات المتفرعة إدخال α-1،6 ربط الجلوكوزيل الربط، ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد
- ثقافات السيانوباكتريال
- تنمو سينكوسيستيس سب. يك 6803 عند 30 درجة مئوية في السائل BG11 المتوسطة 8 ، مع إمدادات ثابتة من الهواء تستكمل مع 1٪ (الخامس / الخامس) كو 2 . تضيء الثقافات باستمرار مع الضوء في كثافة تدفق الفوتون الضوئي من 50 ميكرومتر الفوتون / م 2 / ثانية.
- تنمو سينيكوكوكوس سب. بك 7002 في السائل A + المتوسطة <....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
10 مل من ويلديب سينيكوسيستيس سب. تمت زراعة بك 6803 تحت ظروف فوتووتوتروفيك حتى وصلت قيمة 730nm أود حوالي 0.8. تم حصاد الخلايا ومعلق في 50 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8. تم تعديل قيمة 730nm أود إلى 2-3. تم تحليل محتوى الجليكوجين بعد البروتوكول الموصوف أعلاه. كان محتوى الجليكوجين في أود 730nm 13 ± 1.8 ميكروغرام / مل / أود 730nm ( N = 12). وكان محتوى الجليكوجين بالنسبة لمحتوى ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الخطوات الحاسمة داخل البروتوكول هي الجليكوجين هطول الأمطار وإعادة تعليق. بعد الطرد المركزي التالية هطول الإيثانول، الجليكوجين يشكل بيليه شفافة التي تلتزم بشكل فضفاض إلى جدران أنابيب ميكروسنتريفوج. لذلك، عند إزالة طاف، يجب إيلاء اهتمام خاص حتى لا إزالة بيليه. الجليكوجين بيليه لزجة، و يمكن أن يكون من الصعب انحلال إذا كان يجف. لاحظ أن الانحلال الكامل من بيليه الجليكوجين مهم لأن الانحلال غير مكتملة سيؤدي إلى الهضم الأنزيمي غير فعالة، وبالتالي سوف تؤدي إلى اختلافات كبيرة بين مكررات الت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
ويعترف المؤلفون ببحوث الطاقة الشمالية (أكوفيد، مشروع رقم 24)، و إنوفاتيونفوندن الدنمارك (بانت باور، مشروع رقم 12-131844)، و فيلوم فوندن (مشروع رقم 13363)
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| QSonica Sonicators Q700 | Qsonica, LLC | NA | QSonica |
| SpectraMax 190 Microplate Reader | الأجهزة الجزيئية | NA | Eliza قارئ لوحة |
| رصاصة خلاط العاصفة | القادم Advance | BBY24M-CE | الخرز الخافق |
| Ultrospec 3100 pro الأشعة فوق البنفسجية / مقياس الطيف | المرئي Amersham Biosciences | NA | مقياس الطيف |
| تريس & nbsp ؛ | Sigma-Aldrich | T1503 | Buffer |
| HCl | Merck | 1-00317 | مساعد الأس الهيدروجيني |
| أسيتات الصوديوم | سيجما ألدريتش | 32319 | عازلة |
| Amyloglycosidase (Rhizopus sp.) | Megazyme | E-AMGPU | لإزالة بلمرة الجليكوجين |
| ألفا ، قابل للحرارة (Bacillus licheniformis) | Sigma-Aldrich | A3176 | لإزالة بلمرة الجليكوجين |
| D-Glucose | Merch | 8337 | المعيار لفحص الجلوكوز |
| مجموعة فحص البروتين بيرس BCA ؛ | Thermo Fisher Scientific | 23225 | لتحديد تركيزات البروتين |
| صواني تجفيف الألومنيوم ، VWR | 611-1362 | لتقدير الأوزان الجافة للخلية مجموعة | |
| مقايسة D-Glucose (تنسيق GODPOD) | Megazyme | K-GLUC | لتحديد تركيزات الجلوكوز خبز |
| أكسيد الزركونيوم ، 0.15 مم | Next Advance | ZrOB015 | حبات لتحلل الخلايا في أ أنابيب Bullet Blendar Storm |
| RINO Next | Advance | NA Tubes لتحلل الخلايا في عاصفة Bullet Blendar |
المراجع
- Chen, X., et al. The Entner-Doudoroff pathway is an overlooked glycolytic route in cyanobacteria and plants. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5441-5446 (2016).
- Yang, C., Hua, Q., Shimizu, K. Metabolic flux analysis in Synechocystis using isotope distribution from C-13-labeled glucose. Metab Eng. 4 (3)....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
