本实验方案的目的是为缺乏统一命名和分类标准的蛋白质群组建立一个参考体系。该参考体系将有助于对整个群组进行分析和讨论，并可与已确立的名称一并使用。
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本文内容
摘要
摘要
不同实验室利用不同生物体研究的相关蛋白质可能缺乏统一的命名和分类体系，导致难以整体讨论该蛋白家族，也难以将新发现的序列归入适当的分类背景中。建立一种以与结构和/或功能相关的重要序列特征为优先的参考体系，可作为既有名称的补充，为多样化的蛋白质家族提供一定的系统性。本文以半胱氨酸稳定α-螺旋（CS-αβ）超家族为例，说明如何构建此类参考体系 电子表格软件可以阐明该超家族中现有蛋白质之间的关系，并有助于添加新的序列。它还展示了参考序列如何帮助优化在常用软件中生成的序列比对结果，从而影响系统发育分析的可靠性。对于包含来自广泛分类群的高度分歧序列、且其特征难以通过分子分析充分捕捉的蛋白质组而言，使用参考序列可能尤为有益。
引言
蛋白质的名称应反映其特性以及与其他蛋白质的关系。然而，蛋白质的名称通常在发现时即被确定，随着研究的深入，人们对更大背景的理解可能会发生变化。这可能导致同一蛋白质被多个实验室独立鉴定而出现多个名称，或导致命名规则的变更，或导致当初命名时被认为具有决定性的特征发生变化，从而使该名称不再能充分区分该蛋白质与其他蛋白质。
无脊椎动物防御素为命名法和分类学中的混乱现象提供了一个很好的例子。最早的无脊椎动物防御素报道来源于昆虫，其名称 "昆虫防御素" 基于与哺乳动物防御素的表观同源性而提出1,2术语“防御素”仍在使用，尽管现已明确无脊椎动物和哺乳动物的防御素并不具有共同的祖先。3,4. 根据物种的不同，一种无脊椎动物 "防御素" 可能含有六个或八个半胱氨酸（形成三对或四对二硫键），并具有多种抗菌活性。更复杂的是，具有防御素相同特征的蛋白质并不总是被称为 "防御素，" 例如最近发现的 cremycins 来自 秀丽隐杆线虫5此外，无脊椎动物的大防御素在进化上更可能与脊椎动物的β-防御素相关，而非其他无脊椎动物防御素
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方案
1. 确定目标蛋白质组的特征
- 查阅以往的文献，确定关于被归入该类群所需具备的特征是否存在共识。注意不同研究团队之间存在的任何不一致或观点差异，并纳入可能用于区分不同亚群的特征。
- 若先前文献未涉及定义性特征，可选用被公认为代表该类群的序列作为起点，以识别保守特征。
2. 收集相关序列
- 如果已有综述文献包含了代表该类群的序列分析，应将这些序列纳入原始数据集。根据文献中引用的登录号获取序列，并保存至标准的序列编辑软件中。例如， Lasergene 软件套件中的 EditSeq 或许多可在线免费获取的软件之一。
- 如果相关分组已在某个结构数据库中定义，则应包含该数据库列出的属于该分组的所有序列。 使用数据库中提供的登录号获取序列，并以上述方法保存至标准的序列编辑软件中。
注意：例如，SCOP 数据库中归类于 CS-αβ（蝎毒素样）超家族的序列可在此处找到：http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/data/scop.b.h.c.h.html。 - 执行基本局部比对搜索工具（BLAST）14 通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）提供的公共在线数据库进行检索，以查找可能未被文献或结构数据库收录的序列。为获得最完整的检索结果，应....
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结果
文献中报道的CS-αβ超家族中的序列分组如图4所示。根据每条序列编号所推断的半胱氨酸配对模式，可将其分为五个基本组（表1，中间列）。第1组包含六个半胱氨酸，形成三个二硫键，其序列来源于昆虫、蛛形纲动物、软体动物、线虫和真菌。第2、3和4组均含有八个半胱氨酸，形成四个二硫键。第2组包括昆虫、蛛形纲动物和植物的序列；第3组包括蛛形纲动物、软体动物和线虫的序列；第4组包括刺胞动物、环节动物、软体动物和真菌的序列。第5组为含有十个半胱氨酸的macin类序列。部分序列不完全符合上述模式，但通常更接近于其中某一组。
第1组和第2组似乎共享两个二硫键：C2-C5 和 C3-C6；然而，若将每个序列的编号从其第一个半胱氨酸开始，则无法体现这些二硫键的结构背景。在第1组序列中，C2-C5 形成了CSH模体中的两个二硫键之一，而在第2组序列中，C2-C5 则构成了稳定CS-αβ折.......
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讨论
对某一类蛋白质命名的标准应当明确，但实际情况并非总是如此。具有CS-αβ折叠结构的序列已在多个实验室中利用多种生物体进行了研究，导致命名系统各不相同，且表征程度也存在差异。试图强加一种全新的命名法是不合理的，这会在查阅以往文献时造成极大混乱。可在蛋白质名称之外使用参考编号系统，以阐明该蛋白质相对于超家族的特征。
具有明确命名和分类标准的蛋白质组可能无需通过电子表格生成参考信息，尽管这种方法可用于汇总大量序列并可视化重要特征。序列比对和序列标志图有助于研究每个位点的保守程度，但无法主动突出对结构或功能至关重要的序列特征。以CS-αβ为例的分析重点关注了结构特征，但也可将构成结合位点的特定氨基酸作为定义性特征纳入。随着赋予CS-αβ肽特定抗菌/毒性活性的序列特征被鉴定出来，这些特征可被添加至参考体系中，以基于活性进一步明确分组。本示例中仅使用了预测的成熟肽序列，但如果信号肽或前肽的存在具有重要意义，则可为每条序列补充该信息。若特定的插入或缺失事件以及内含子位置具有信息价值，也可一并纳入。使用MrBayes进行系统发育分析的一个优势在于其不仅限于分子数据——它还可分析编码其他可能具有进化.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
正在进行的缓步动物抗菌肽研究得到了中西部大学研究与资助项目办公室（ORSP）院内资金的支持。ORSP 在研究设计、数据收集、分析、解释以及论文撰写方面均未发挥作用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BLAST 网页 | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi | ||
| EditSeq (Lasergene 套件) | DNASTAR | https://www.dnastar.com/t-allproducts.aspx | |
| Excel 2013 | Microsoft | ||
| FigTree | http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/ | ||
| MEGA | www.megasoftware.net | ||
| MrBayes | http://mrbayes.sourceforge.net/ | ||
| SCOP 数据库 | http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/ |
参考文献
- Matsuyama, K., Natori, S. Purification of Three Antibacterial Proteins from the Culture Medium of NIH-Sape-4, an Embryonic Cell Line of Sarcophaga peregrina. J Biol Chem. 263 (32), 17112-17116 (1988).
- Lambert, J., et al.
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