Method Article

アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイによる単一細胞におけるタンパク質をカウント

DOI:

10.3791/56110

⸱

July 6th, 2018

 ,  ,  , 
1Institute of Chemical Biology, Department of Chemistry, Imperial College London

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイ (Adm)、単一セルの絶対蛋白質量を決定できる液滴アレイ ・ ベース メソッドをご紹介します。ひと癌細胞における癌抑制タンパク質 p53 の発現の多様性を特徴付けるための Adm の機能を紹介します。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

しばしば細胞挙動と細胞応答は多くの細胞の応答が複雑な人口の内で豊富な単一のセル動作をマスキング平均結果として一緒にプール、人口レベルで分析しました。単細胞タンパク質検出と定量化技術は、近年顕著な影響を与えたが。ここでアドレス指定可能な液滴マイクロ アレイに基づく実用的で柔軟な単一細胞解析プラットフォームをについて説明します。本研究では、ターゲット蛋白質の絶対コピー数が単一セルの解像度を測定する方法について説明します。腫瘍抑制因子 p53 は、非正常な p53 表現パターンを示す総癌の 50% 以上のひと癌の最も一般的変異遺伝子です。プロトコルでは、発現の変動を正確に判断する単一分子分解能 10 nL 液滴内 1 つのひと癌細胞は隔離され、p53 蛋白のコピー数の測定を作成する手順について説明します。メソッドは、任意のセル型主原料を含む興味の任意のターゲット蛋白質の絶対コピー数を決定するために適用可能性があります。

Introduction

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このメソッドの目的は、単一セルの解像度を持つセル人口のターゲット蛋白質の豊富さで変化を決定することです。単一細胞解析は、いくつかの伝統的なアンサンブル生化学的方法では利用できない利点を提供します。1,2,3,4,5まず、単一セルのレベルで働く伝統的なアンサンブル生化学的手法で発生するそれ以外の場合、平均することによって失われるだろう細胞集団の豊富な多様性をキャプチャできます。仕事馬の生化学的方法の大半を連れた、必要とされる職務とは多くの場合、結果を生成する細胞の数百万。もちろん、全体細胞集団の評価の結果によって異なりますいくつかの要因、たとえば、不均質構造タンパク質発現蛋白質量分布のいくつかの重要な機能を見逃す可能性があります。実用的な観点から単一のセル技術の必要な感度させる機能により敏感の一括技術も十分ではない生物学的材料の量を操作することができます。このキーの例は珍しいセルなどの循環癌細胞 (Ctc) 描画単一 7.5 mL の血液に存在する 10 の Ctc より予後見通しで貧しい患者のためにもどこの研究です。6ここでオイル キャップの液滴を用いた抗体アッ....

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Protocol

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1. 準備

  1. チップとプリントの抗体のマイクロ アレイ
    1. 抗体のマイクロ アレイをサポートする官能基化 coverslip に接着剤シリコーン/アクリル アイソレータを取り付けます。これをチップと呼びます。
      注: さまざまな表面化学は、アドレス指定可能な液滴とその適合性についてテストされています。5表面の化学的性質は、代替の捕獲のエージェント用に最適化する必要があります。ADM アイソレータ、商業的に利用可能なまたはアクリル レーザー切断によって生成される (CAD ファイルのダウンロードとしてこの作業で使用する免震装置を提供;補足コード ファイルを参照してください)。
    2. Microarrayer に切り替え、湿度を 75% に設定します。
      注: 相対湿度はマイクロ アレイ端子から印刷の溶液の蒸発を低減し、イントラ間 spot 変化を減少します。
    3. 5 分間超音波処理による洗浄ピンのマイクロ アレイ ピンを清掃します。超純水洗浄ボトルを使用してくださいピンをすすいで乾燥窒素を使用してください。
      注: のみピン先端を浸すようピンを中断します。適切なドリル穴セットを顕微鏡スライドはピン ホルダーを取得できない場合に役立ちます。
    4. 5 mL の 0.01% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) を添加した 1.....

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Results

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P53 の絶対根元タンパク質コピー数は、ひと大腸癌細胞株、ある細胞の単一セルの解像度が定められました。P53 桁違いに異なり、休憩する細胞集団内のセル サイズとタンパク質コピー数の間弱く肯定的な相関関係を示す方法を紹介しています。

アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイは、水滴は抗体の場所にスポットで調剤され、オイルを頂いたときに形成されています。ここでは、水滴は敏感な p53 蛋白質の試金をサポートします。Coverslips は連絡先 microarrayer とピンを使用してキャプチャ抗体スポットで配列されます。抗 p53 キャプチャ抗体は、市販 ELISA テスト キットから取得されます。印刷の条件は、キャプチャ スポットがあたり 6.2 ± 0.5 × 105タンパク質の最大キャプチャ容量直径約 100 μ m など。32

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Discussion

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アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイは、単一細胞内でタンパク質の絶対コピー数を決定する定量的敏感かつ拡張可能な方法です。

非特異的結合のレベルを制限すること (NSB) は、低として可能な限り検出限界を達成するためにプロトコル内で重要です。蛋白質および他の生化学的な種がありますバインド インターフェイス液滴内に存在の数非具体的-coverslip 表面、スポットの抗体・油/水界面。タンパク質は、インターフェイスまたはオイル自体に分割が失われることができます。我々 は 4 %bsa 水溶液液滴内に存在がプロトコルで指定した抗体を用いてタンパク質の NSB を限ることができることを示しています。代わりとなる蛋白質の目標とそれらを検出するために使用する抗体は、代替ブロック的なアプローチ、そのような非イオン性洗剤または互換性のある界面活性剤を必要があります。フッ素オイルもソリッド オイルとしての適合性をテストできます。このような場合、臨界ミセル濃度とキャッピングの油の密度などの追加の考慮事項を行う必要があります。

各スポットの位置配.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

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ASR は、実験を設計プロトコルを開発し、データを分析しました。SC と PS は、セル サイズの実験を行った。ASR では、OC は、原稿を書いていた。著者は機器へのアクセスを提供するため教授デビッド r. Klug のサポートを感謝したいです。著者作製と試作設備にアクセスするために帝国大学高度な Hackspace を感謝したいです。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
細胞培養
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)Life Technologies10010015
DMEM 高グルコースSigmaD6429
ウシ胎児血清(FBS)BiochromS0115
細胞培養フラスコCorningSIAL0639
Trypsin/EDTABiochromL2153
名前会社カタログ番号コメント
Microarray
Microcontact ArrayerDigiLab、英国OmniGridマイクロ
マイクロコンタクトピンArrayIt、USA946MP2
Coverslips (Nexterion)Schott, Europe1098523サイズ (mm): 65.0 x 25.0;厚さ(mm)0.17
p53捕捉抗体EnzoADI-960-070
p53検出抗体、Alexa Fluor 488Santa Cruzsc-126ストック濃度200μg/mL
生理食塩水-クエン酸ナトリウム緩衝液Gibco15557-044
ベタインシグマ61962
ドデシル硫酸ナトリウムシグマL3771
384 ウェルプレート (低容量)シグマCLS4511
窒素ガスボンベBOC工業グレード、無
<強力>名前会社strongカタログ番号コメント<
strong>Droplets
MicromanipulatorEppendorfPatchman NP2
Manual MicroinjectorEppendorfCellTram Vario
MicropipetteOrigio, DenmarkMBB-FP-L-0
シリンジポンプKDサイエンティフィックKDS-210
100 μLシリンジハミルトン81020ガスタイト、PTFE ルアーロック
1 mLシリンジハミルトン81327ガスタイト、PTFE ルアーロック
シリコンアイソレーターGrace Bio-LabsJTR24R-A-0.56x4 ウェルシリコンアイソレーター 接着剤付き
レーザーカッターVersaLASEVLS2.30 CO2 レーザー 3Wカスタムアイソレーターのレーザー切断用
厚さ 1mm アクリルシートカスタムアイソレータのレーザー切断のためのClarex精密シート001
マイクロアレイカバースリップにカスタムアイソレータを接着するために使用される粘着シート3M
スーパーグルーロックタイトLOCPFG3T
150 μm ID/360 μm 外径溶融シリカチューブIDEXFS-115
1.0 mm ID/1/16"外径PFAチューブIDEX1503
0.014"ID/0.062インチOD PTFE チューブKinesis008T16-100
1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP チューブIDEX1673
ウシ血清卵白 (BSA)フィッシャー サイエンティフィックBP9700100
鉱物油SigmaM5904
超純水ミリポア、ドイツMilliQ
名前会社名カタログ番号コメント
顕微鏡&光学
TIRF顕微鏡、エンコードXYステージニコン、日本ニコン Ti-E
EM-CCDAndor Technologies、アイルランドIXON DU-897E
レーザー励起光源Vortran、米国Stradus 488-50
光学分解レーザー光源Continuum、米国Surelite SLI-10
TIRFクロマ用フィルターキューブ、米国z488bp
レーザー2000年用顕微鏡フィルターキューブLPD01-532R-25
名前会社カタログ番号コメント
ソフトウェア
フィジーのオープンソース画像解析ソフトウェア
MatlabMathworksバージョン 7.14 以降画像解析ソフトウェア
標識酸素Weatherall-UK 顕微鏡光学溶解、英国

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).
  2. Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. Single-cell analysis tools for drug discovery and development.....

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