Использование капсул для отрицательного окрашивания вирусных образцов в области биологического обогащения

Summary

В этом протоколе содержится инструкция для образцов отрицательного окрашивания вирусов, которые могут быть легко использованы в лабораториях BSL-2, -3 или -4. Он включает в себя использование инновационной капсулы для обработки, которая защищает сетку электронной микроскопии трансмиссии и обеспечивает удобство работы пользователя в более бурных средах в рамках биоконцентрации.

Abstract

Передаточная электронная микроскопия (TEM) используется для наблюдения ультраструктуры вирусов и других микробных патогенов с нанометровым разрешением. Большинство биологических материалов не содержат плотных элементов, способных рассеивать электроны для создания изображения; Поэтому требуется отрицательное пятно, которое помещает плотные соли тяжелых металлов вокруг образца. Чтобы визуализировать вирусы в суспензии под ТЕМ, их следует наносить на небольшие сетки, покрытые прозрачной поверхностью толщиной всего нанометров. Из-за их небольшого размера и хрупкости эти решетки трудно обрабатывать и легко перемещать воздушными потоками. Тонкая поверхность легко повреждается, оставляя образец трудным или невозможным для изображения. Инфекционные вирусы должны быть обработаны в шкафу для биобезопасности (BSC), а некоторые требуют лабораторной среды для биоконцентрации. Окрашивание вирусов на уровнях биобезопасности (BSL) -3 и -4 особенно сложно, поскольку эти среды более бурные и требуются технические специалисты tO носить средства индивидуальной защиты (СИЗ), что снижает ловкость.

В этом исследовании мы оценили новое устройство, помогающее отрицательным окрашивающим вирусам в биоконцентрации. Устройство представляет собой капсулу, которая работает как специализированный наконечник пипетки. Когда сетки загружаются в капсулу, пользователь просто отсасывает реагенты в капсулу, чтобы доставлять вирус и пятна в инкапсулированную сетку, тем самым устраняя обработку пользователем сеток. Хотя этот метод был разработан специально для использования в биологическом обогащении BSL-3 или -4, он может облегчить подготовку проб в любой лабораторной среде, обеспечивая легкое отрицательное окрашивание вируса. Этот же метод может быть также применен для получения отрицательно окрашенных образцов ТЕМ наночастиц, макромолекул и аналогичных образцов.

Introduction

Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЕА) является эффективным инструментом для просмотра морфологии и ультраструктуры биологических образцов, которые слишком малы, чтобы их можно было увидеть с помощью обычного светового микроскопа ^{1 , 2 , 3 , 4} . TEM снимают электроны через очень тонкий образец, создавая изображение с более высоким разрешением, поскольку электроны имеют гораздо более короткую длину волны, чем свет. Регионы образца, которые изгибают или блокируют электроны, выглядят темными, а области, которые являются электронно-лучис....

Protocol

1. Подготовка эксперимента в среде BSL-2 до работы с образцами вирусов

1. Подготовьте или купите медные сетки TEM Formvar и углеродного покрытия, обычно 200-400 меш.
2. Вставьте покрытые сетки ТЕА в капсулы.
   1. Используйте увеличенный объектив, чтобы облегчить выполнение этого процесса. Одна или две сетки могут быть вставлены в каждую капсулу. Предварительно загруженные капсулы можно приобрести, чтобы устранить этот шаг, если это необходимо.
3. Перенесите капсулы со вставленными сетками, покрытыми ТЕА, вместе с другими материалами и реагентами, в биоконцентрации, где вирусы будут отрицательно окрашены.

....

Results

Метод капсул дает отрицательное окрашивание хорошего качества для изображений ТЕА:

Во-первых, мы оценили качество изображений, сгенерированных с использованием как ручного метода капель, так и методов капсул для отрицательного окрашивания эболавира Заира. Эболавирусы являются членами семейства Filoviridae вместе с вирусом Марбурга. Эболавирус обычно составляет от 80 до 100 нм в диаметре и может иметь длину более 1000 нм........

Discussion

Отрицательное окрашивание является ценным методом ТЕА для оценки и калибровки вирусов, белковых комплексов и наночастиц. Классификация протоколов на протяжении более полувека была составлена ​​каплеобразным составом этих образцов путем ручного перемещения сеток от реагента до отрицательных пятен. Это простой процесс, но требует опыта, полученного в результате обучения для успешного завершения. Отличное отрицательное окрашивание по-прежнему считается современным набором навыков и очень востребованным во многих лаборатори.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Формвар/углеродное покрытие ТЭМ	решетки SPI	3420C-MB	200 меш Cu Pk/100
mPrep/g капсулы	EMS	85010-01	коробка
mPrep/f соединители	EMS	85010-11	стандартные 16/Pk
glutaraldehdyde	EMS	16320	50% раствор, ЭМ класс
Тетраоксид осмия	EMS	19190	4% водный раствор
Уранилацетат	EMS	22400	порошок
калия фосфовольфстиновая кислота	EMS	19500	порошок
фильтровальная бумага	ватман	1450-090	размер 50
Трансмиссия Электронный микроскоп	JEOL	JEM-1011	TEM