動物の最も一般的な腸内容の分析は、視覚的な。餌生物の形態の多様性についての強烈な知識を必要とする、彼ら柔らかい bodied 獲物を逃すし、獲物の強力な粉砕により、ヨコエビ類を含むいくつかの生物はほぼ不可能。昆虫の詳細な斬新な遺伝的アプローチ獲物ヨコエビの国会で身分証明書を提供します。
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この記事について
サマリー
要約
食物網の分析は、生態系の理解を深めるために不可欠です。たとえば、食物網の相互作用は、非在来種の侵入によって引き起こされる深刻な変更を受けることができます。ただし、フィールドの捕食者-被食者相互作用の正確な同定は多くの場合困難であります。これらの分析は、腸内容の視覚的評価や安定同位体比 (δ15N そして δ13C) の分析にしばしば基づいています。形態学上の多様性や捕食生物の正確な同定の障害につながる、個々 の餌生物から同位体署名このようなメソッドは、それぞれ、包括的な知識を必要です。浸軟、経口摂取と餌生物の消化によって特定の種の同定困難ため visual 腸内容分析は特に柔らかい bodied 餌生物を過小評価します。したがって、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) による戦略、たとえばグループ特定のプライマー セットを使用、食物網の相互作用の調査のための強力なツールを提供します。ここでは、核リボソーム デオキシリボ核酸 (rDNA) のグループ特定のプライマー セットを使用してフィールドから消費者を昆虫の消化管内容物を調査するための詳しいプロトコルについて述べる。DNA がすることができます (小分類) の場合全体の標本から抽出またはフィールドの標本の消化管内容物から。存在と DNA のテンプレートの機能の効率テスト個人から直接確認する必要がある普遍的なプライマーを用いた DNA のそれぞれのサブユニットをターゲットに設定します。また、ポリアクリルアミドのゲルを使用して後続の一本鎖コンフォメーション sscp 解析と変更されていないグループ固有のプライマーと PCR によって種レベルまでさらに組み合わせて消費獲物を定めることができることを示します。さらに、ラベルとして異なった蛍光染料の使用できる並列スクリーニング自動化されたフラグメント解析による複数の腸コンテンツ サンプルから別の獲物グループの DNA のフラグメントを示す.
概要
栄養相互作用と食物網動態の大半を占める捕食者-被食者の相互作用、物質と食物網内および生態学の主要な目標の 1 つである生態系間を通してエネルギーのフラックスを特徴付ける重要な側面1。 ソースの決意と炭素と栄養素の流れは生態系2間の生態的結合の理解を促進します。ただし、有機物および栄養素のフラックスも生物3の動きには、川などの流域の生態系はだけはリンクされません。したがって、これらのシステムをリンクしているリソースの流れを中断する生息地の変化強く変更できます両方生態系の食物網だけでなく直接、また、間接的捕食者-被食者コミュニティのそれぞれの構成を変更することによって。たとえば、単一の捕食者の種 (例えばニジマス)4の動きにリンクする食物網の変化が示されています。このような変更は潜在的生物多様性と水界生態系の機能を脅かします。したがって、フィールドにおける捕食者-被食者の相互作用の分析水生生態系のネイティブの生物多様性、水管理など、人為的な環境変化の影響を判断することが不可欠です。
栄養連携を追跡は複雑なシステムで難しいので、フィールド5の相互作用の評価を有効にするいくつかのアプローチを確立されています。従来、供給分野における....
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プロトコル
1 ですフィールドから動物を収集し、遺伝子の腸内容分析のサンプルを準備します。
。 各サイトで- 収集動物消費者単一チューブへの興味の種の個体を整理し、直接液体窒素やドライアイス腸クリアランスと DNA の分解を防ぐためにそれらを凍結します
。 注意: いくつかの動物はアルコールは、それらを殺す前に繰り返す傾向があるのでアルコールでサンプルを保存しないでください 。
- のみ使用の中型および大きい胃腸地域 (約 > 3 mm) 昆虫種の遺伝的腸内容分析試料の残りの問題は、他のプロシージャ (例えば、 安定同位体の使用できるように分析)。ミズダニのような非常に小さな分類群を調査するときこれが該当するではないことに注意してください。したがって、1.2.1、1.2.2 の手順を省略できます。
- は、個人を少し解凍そして慎重にステンレス鉗子を用いた顕微鏡下での消化管を解剖します。問題の損失を避けるために胃腸を穴をあけることを確認してください 。
- クリーン鉗子除染液を使用して各消化管の準備の後、DNA および RNA の汚染を削除します。したがって、鉗子除染液で 10 分間を、インキュベートします。その後、残留のトレースを削除し、糸くずのペーパー タオルでふいて滅菌水でそれらをすすいでください 。
- 2.0 mL 安全ロック反応への転送切り裂かれた消化管チューブ含む 440 μ L (....
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結果
正常に、このプロトコルの異なる研究内食事分析で説明されている手順を使用しました。このセクションでは、プロトコルのさまざまなセクションの適用を記述する例を示す.
例として、著者28と SSCP 解析による PCR 産物のさらに下流解析の可能性によって確立されたグループ特定のプライマー セットの有効性を示す、給餌実験が実施されました。Dikerogammarus villosusの捕食者と獲物としてCaenis属幼虫の個体はライン川、背水のカールスルーエ (ドイツ) の近くで捕獲されました。研究室では、捕食者と獲物のイチイは 20 ° C でフィルター処理された河川水で別々 に保管された、36 時間に飢えていた。実験のため端脚類標本は、フィルター選択されたストリーム水 (100 mL)、個別にうんざりして、30 分間 2 〜 3 Caenis幼虫と、液体窒.......
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ディスカッション
ここでは、簡単かつコスト効率の高い PCR に基づく同じ標本の他の非分子分析と組み合わせることができます rDNA 領域のグループ固有プライマーを介してフィールド サンプルから捕食者-被食者相互作用の決定法を提案する.ただし、プロトコルの中でいくつかの重要な手順があります。まず、使用されるプライマーの特異性を保証することは不可欠です。第二に、それは胃腸管の準備、その後の DNA の抽出の間に汚染や腸のコンテンツの材料の損失を避けるために重要です。クロス サンプルの汚染は、獲物の DNA の誤検出につながることができます、腸の材料はほとんど行方不明につながる可能性がありますコンテンツの損失は餌種を消費しました。それぞれのサブユニットと解析 (プロトコルのセクション 2) 用のテンプレートの機能の効率に属する rDNA の存在の検証は、摂餌量に関する代表的な情報の収集に不可欠です。これは、特に消費者を餌になって捕食グループの DNA が検出された25,27できますない場合、非常に重要です。さらに、Pcr (ステップ 3.1、.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
研究所からシルクはクラッセンは、生態系の解析と評価 (ガイアウッド)、このプロトコルで使用されるグループ特定のプライマー セットの確立で彼女の援助のため RWTH Aachen を感謝いたします。我々 はまたミズダニの実験でピーター ・ マーティンと協力のキール大学からローラ Schynawa をありがとうございます。スムーズに実行し、企業とのカタログ番号の登録の準備のラボの維持の技術研究室助手を感謝いたします。この作品は、ドイツ研究振興協会 (DFG; プロジェクト GE 2219/3-1) によって支えられました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 液体窒素 | NA | 大型無脊椎動物のフィールドサンプルを研究室に輸送するため。 | |
| 1.5 ml反応チューブ - セーフロック | Any | NA | 現場での消費者検体の採取とその後の液体窒素反応チューブの保存のために、必ずしもPCRクリーンである必要はありません。チューブの爆発を防ぐために、チューブの蓋に針で穴を開ける必要があります。 |
| 実体顕微鏡 | 任意の | NA | 倍率が関心のある消費者のサイズの胃腸管を準備するのに適していることを確認してください。 |
| ペトリ皿 | 任意の | NA | ステレオマイクロスコープの下で消費者標本の胃腸管を解剖します。 |
| ステンレス製フォーセップ:デュモン鉗子No.7 | バイオフォーム | B40d | この湾曲したステンレス製鉗子は、胃腸管に穴を開けることなく、湾曲した部分の間に固定された標本を保持するために非常にヘリフルな場合があります。 |
| ステンレス製フォーセップ:デュモン鉗子 電子5号バイオ | フォーム | B40b | この微細なステンレス製鉗子は、消費者検体の胃腸管の調製に最適です。 |
| DNA-ExitusPlus | AppliChem | A7409,1000RF | DNAおよびRNA汚染除去のための除染ソリューション |
| ファズフリーペーパータオル | 任意の | NA | |
| ラボスケール | 任意の | NA | 精度は少なくとも0.01gである必要があります。 |
| マイクロリットルピペット(0.5-10 / 10-100 / 50-200 / 100-1000 μL) | Any | NA | |
| Safe-Lock Tubes 2.0 ml | VWR | 211-2165 | これらの反応チューブには、DNA、DNase、RNase、PCR阻害剤が含まれていないことが重要です(PCRクリーン)! |
| セーフロックチューブ 1.5ml | VWR | 211-2164 | これらの反応チューブには、DNA、DNase、RNase、PCR阻害剤が含まれていないことが重要です(PCRクリーン)! |
| 塩化ナトリウム ≥99.5%, p.a., ACS, ISO | carlroth | 3957.3 | DNAの抽出に必要な塩抽出バッファー(SEB)および5M NaCl溶液用。 |
| トリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン トリス | ・カールロス | 4855.2 | 塩抽出緩衝液(SEB)およびTBE緩衝液 |
| マイクロリットルピペット(0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) | carlroth | 8043.1 | 塩抽出バッファー (SEB) および TBE バッファー |
| 用 ホウ酸 ≥99.8 %、p.a.、ACS、ISO | carlroth | 6943.2 | TBEバッファ用。市販のTBEバッファーが得られた場合は不要です。 |
| ドデシル硫酸ナトリウム(SDS) | carlroth | 4360.1 | |
| プロテイナーゼKlyophilの抽出用。 | carlroth | 7528.1 | 10 mg / mlを含む作業溶液を準備します。 |
| TissueLyser II | Quiagen | 85300 | サンプルの均質化のためのビーズミル。 |
| ステンレス鋼ビーズ、5 mm | Quiagen | 69989 | サンプルの均質化用。 |
| 加熱サーモシェーカー | 任意の | NA | |
| ボルテックスミキサー | 任意の | NA | |
| 冷蔵遠心分離機:himac CT 15 RE | 日立 | NA | DNAの抽出中の遠心分離に使用される冷蔵遠心分離機(プロトコル1)。 |
| イソプロパノール | カールロス | 6752.5 | |
| エタノール99.8%、p.a. | NA | ||
| 水 分子生物学グレード (ddH2O) | AppliChem | A7398,1000 | ヌクレアーゼフリー (ストリーム滅菌およびDEPC処理済み) DNAの再懸濁に使用され、原稿内でddH2Oを参照する場合は常に、 |
| 未修飾オレゴヌクレオチド、 | ユーロフィン、MWG、オペロン | NA | プライマー、非標識 |
| 、修飾オレゴヌクレオチド | Metabion International AG | NA | プライマー ラベル付き |
| peqGOLD Taq オールインクルーシブ | VWR Peqlab | 01-1000 | Taq オールインクルーシブ PCR 反応混合物 (反応バッファー Y および S、dNTP および MgCl2) |
| Primus 96 アドバンスドグラジエントサーモサイクラーまたは peqStar96x ユニバーサルグラジエント | Peqlab | NA | プライマーセットは、もともとPrimus 96アドバンスドグラジエントサーモサイクラーで確立されました。このサイクラーはかなり古いものだったので、peqSta96x(古いモデルをシミュレートすることも可能)を使用して、同じ条件下でプライマーセットが効率的で特異的であるかどうかを確認しました。しかし、テストでは、古いマシンのシミュレーションを使用せずに、プライマーが良好に機能し、依然として特異的であることが示されました(Koester et al.2013を参照)。 |
| 標準96ウェルPCRプレート | VWR Peqlab | 732-2879 | PCR反応に使用されます。 |
| ロープロファイルチューブストライプ 0.15ml フラットキャップストライプ付き | VWR Peqlab | 732-3223 | PCRプレートを閉じるために使用されるキャップストライプ。 |
| アガロース | Peqlab | 35-1020 | ゲル電気泳動に使用されます。 |
| マイクロ波 | 任意の | NA | |
| コニカルフラスコ | 任意の | NA | |
| 測定シリンダー | 任意の | NA | |
| 水平電気泳動ユニットと歯付きそれぞれのコーム | 任意の | NA | アガロースゲル電気泳動用。 |
| 電気泳動電源 PS3002 | Life Technologies | NA | |
| Ethidium bromide solution 1 % | carlroth | 2218.1 | アガロースゲルの染色浴の調製に使用されます。 |
| ホルムアミド | カールロス | 6749.1SSCP | 分析用の変性バッファーに必要です。 |
| ブロムフェノールブルー | AppliChem | A3640.0010 | アガロースゲル電気泳動用のローディング色素に必要です。 |
| ショ糖 | カールロス | 4621.1 | アガロースゲル電気泳動用のローディング色素に必要です。 |
| 100 bp-DNA-Ladder extended | carlroth | T835.1 | アガロースゲル電気泳動のサイズ標準として。 |
| UVドキュメンテーションシステム | Any | NA | ゲル電気泳動の結果を可視化します。 |
| ロチフォア NF-アクリルアミド/ビス溶液 40 % (29:1) | carlroth | A121.1 | ポリアクリルアミドゲルの調製用。 |
| ペルオキシ二硫酸アンモ | carlroth | 9592.2 | ポリアクリルアミドゲルの調製用。 |
| フォールドバッククリップ(32mm) | 任意の | NA | ポリアクリルアミドゲルの調製用。 |
| 正方形のプラスチックボックス(21 × 6.5 × 5 cm) | 任意の | NA | ポリアクリルアミドゲルの調製用。 |
| テトラメチルエチレンジアミン(TEMED) | carlroth | 23.67.1 | アクリルアミドゲルの調製用。 |
| ビーカー | Any | NA | |
| RC 10 デジタルチラー | VWR | 462-0138 | ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用したSSCP分析用。 |
| 縦型電気泳動ユニット P10DS (OWL Separation Systems) | VWR | 700-2361 | ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたSSCP分析用。 |
| ノッチ付きガラスプレート | VWR | 730-0261 | ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたSSCP分析用。 |
| ブランクガラスプレート | VWR | 730-0260 | ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたSSCP分析用。 |
| スペーサー | VWR | 730-0262 | ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたSSCP分析用。 |
| 25歯のコーム | VWR | 730-0294 | ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたSSCP分析用。 |
| 振とうプラットフォーム | Any | NA | 染色浴の絶え間ない振とうに。 |
| GelStar核酸染色剤(ロンザ・ロックランド社) | Biozym | 850535 (50535) | ポリアクリルアミドゲルの染色用。 |
| GenomeLab DNAサイズ スタンダードキット 400bp | AB Sciex | 608098 | 自動フラグメント解析用。バッチBのサイズ標準。 |
| GenomeLab DNAサイズ スタンダードキット 600bp | AB Sciex | 608095 | 自動フラグメント解析用。バッチAのサイズ標準。 |
| サンプルローディングソリューション(SLS) | AB Sciex | 608082 | 自動フラグメント分析用。 |
| シークエンツィングプレート - 96ウェルポリプロピレンPCRマイクロプレート | Costar | 6551 | 自動フラグメント分析用。 |
| プレート式遠心分離機、PerfectSpin P | VWR Peqlab | NA | ミニプレート遠心分離機で、PCR産物のスピンダウンに使用されます。 |
| バッファープレート - 96ウェル EIA/RIA 透明 平底ポリスチレン未処理 マイクロプレート | コーニング | 9017 | 自動フラグメント分析用。 |
| GenomeLab Seperation buffer | AB Sciex | 608012 | 自動フラグメント解析用。 |
| 分離ゲル - LPAI | AB Sciex | 608010 | 自動フラグメント分析用。 |
| Sequenzer - CEQ8000 Genetic Analysis System | ベックマン・コールターNA | 自動フラグメント解析用。 | |
| GeneMarker V1.95 | Softgenetics | NA | 自動フラグメント解析結果を解析します。 |
参考文献
- Carreon-Martinez, L., Heath, D. D. Revolution in food web analysis and trophic ecology: diet analysis by DNA and stable isotope analysis. Mol Ecol. 9 (1), 25-27 (2010).
- Hardy, C. M., Krull, E. S., Hartley, D. M., Oliver, R. L.
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