Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы продемонстрировать, как представлять одоранты с низкой летучестью для регистрации одиночного сенсиллы у нейронов обонятельных рецепторов Drosophila, которые реагируют на длинноцепочечные кутикулярные феромоны.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Электрофизиологическая запись из
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Насекомые полагаются на их обоняние, чтобы вести широкий диапазон поведения, которые имеют решающее значение для их выживания, таких как поиск пищи, избегание хищников, откладка яиц и спаривание. Мириады химических веществ различной летучести были идентифицированы как естественные одоранты, которые активируют нейроны обонятельных рецепторов насекомых (ORNs). Однако изучение обонятельных реакций на низколетучие одоранты затруднялось неспособностью эффективно представлять такие стимулы с использованием обычных методов доставки запаха. Здесь мы описываем процедуру, которая позволяет эффективно представлять одуранты с низкой летучестью для записи одиночной чувствительности in vivo (SSR). Минимизируя расстояние между источником запаха и тканью-мишенью, этот метод позволяет применять биологически важные, но до сих пор недоступные одоранты, включая пальмитолеиновую кислоту, стимулирующий феромон, продемонстрированный эффект на ОРН, участвующих в ухаживании и спаривании 1 .Таким образом, наша процедура дает новый путь для анализа большого количества одорантов с низкой летучестью для изучения обоняния насекомых и обмена феромонами.
Введение
Drosophila ORN реагируют на огромное количество одорантов с широким диапазоном длин углеродных цепей и различными функциональными группами, включая сложные эфиры, спирты, кетоны, лактоны, альдегиды, терпены, органические кислоты, амины, соединения серы, гетероциклики и ароматические соединения 2 , 3 . Одоранты, различающиеся по своим физико-химическим свойствам, могут иметь заметно различную летучесть, определяемую давлением паров соединения. Примечательно, что биологически значимые одоранты для Drosophila melanogaster сильно отличаются от их летучести. Например, Ir92a ORN реагируют на....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка аппаратного обеспечения для записи at4
- Используйте инструмент для снятия пипетки, чтобы подготовить электроды с капиллярами из алюмосиликатного стекла (OD 1,0 мм, ID 0,64 мм). Немного закруглите наконечник контрольного электрода с помощью пары тонких пинцетов, чтобы облегчить вставку в клипеус мухи ( то есть закругленную пластину на передней части головки мухи, выше ротовой части).
ПРИМЕЧАНИЕ. В этом исследовании использовались 7-дневные мужчины WT (Берлин). Используйте солевой раствор AHL 14 в качестве электролита для обоих электродов. - Подготовить 1 л АГЛ путем смешивания 900 мл дистиллирован....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Наша методика была успешно применена для определения относительной эффективности транс- ( рис. 5А ) и цис ( рис. 5В ) изомеров пальмитолеиновой кислоты. Наш представитель данные показывают , что транс - -palmitoleic кислота представляет собой более эффективный лиганд для Or47b ORNs по сравнению с цис - изоформы (рис 5C). Один нейрон регистрировался с каждой мухи, .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы описали процедуру, с помощью которой реакции OR47b ORN на пальмитолеиновую кислоту могут быть надежно индуцированы и записаны. Мы модифицировали традиционный метод доставки запаха на дальние расстояния 2 , 7 , 10 для устранения проблемы недостаточной доставки фекалий-феромонов. Мы рассмотрели вопрос о низкой волатильности одорантов, поставляя соединение через патроны одоранта, открытие которых расположено в пределах ми.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим Е. Чжан за помощь с образцами следов и Тин Ки Цанг за помощь с картинками. Эта работа была поддержана премией Ранней карьеры Рэя Томаса Эдвардса и грантом NIH (R01DC015519) грантам C.-YS и NIH (R01DC009597 и R01DK092640) на JWW
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Подготовка Настройка и Прочные материалы | |||
| Прибор для вытягивания пипеток | Sutter Instruments Novato CA США | P97 | Дозатор |
| Боросиликатные стеклянные капилляры | World Precision Instruments Sarasota FL США | 1B100F-4 | для изготовления удерживающих стержней |
| Алюмосиликатные стеклянные капилляры | Sutter Instruments Novato CA США | AF100-64-10 | для изготовления электродов |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific Pittsburgh PA США | 12-550-143 | для станции подготовки к полетам |
| Постоянная двусторонняя лента | Scotch St. Paul MN США | NA | для станции подготовки к полетам |
| Вертикальный микроскоп | Olympus Shinjuku Tokyo Japan | BX51 | для регистрирующей установки |
| Plastalina modeling clay | Van Aken North Charleston SC США | B0019QZMQQ | для станции подготовки и для стабилизации удерживающего стержня |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0,45 мм | Nalgene Rochester NY США | #156-4045 | для стерилизации раствора AHL |
| Name | Company | Номер в каталоге< | strong>Комментарии |
| >Материалы картриджей | |||
| 200 и микро; L наконечник для пипетки | VWR Radnor PA США | 53508-810 | для изготовления картриджей с запахом и подготовки к мухам |
| Фильтровальная бумага | Whatman Maidstone Kent UK | 740-E | для производства картриджей с запахом |
| Вакуумный десикатор | Cole-Parmer Vernon Hills IL США | VX-06514-30 | для испарения этанола растворителем |
| Name | Company | Номер в каталоге | Комментарии |
| >Odorant Materials | > | ||
| цис-пальмитолеиновая кислота | Cayman Chemical Ann Arbor MI США | #10009871 (CAS # 373-49-9) | Or47b одорант |
| транспальмитолеиновая кислота | Cayman Chemical Ann Arbor MI США | #9001798 (CAS # 10030-73-6) | Or47b odorant |
| Ethanol | Spectrum Chemical MFG. Нью-Брансуик, штат Нью-Джерси, США | E1028-500MLGL | для разбавления пальмитолеиновой кислоты |
| Name | Company | номер в каталоге | Комментарии |
| Материалы для установки оснастки | Микроманипулятор картриджа | ||
| Odorant | Siskiyou Grants Pass OR США | MX130R | для позиционирования программного обеспечения Flow Vision от ольфактометра |
| Alicat Tuscon AZ США | программное обеспечение FLOWVISIONSC | для управления расходом | |
| Регулятор расхода Контроллер массы | Alicat Tuscon AZ США | MC-2SLPM-D | для управления расходом увлажненного воздуха |
| Контроллер массы | Alicat Tuscon AZ США | MC-500SCCM-D | для управления расходом для стимуляции запаха |
| Clampex | Molecular Devices Sunnyvale CA США | версии 10.4 | Программное обеспечение для сбора данных |
| Воздуходаточная трубка | Ace Glass Vineland NJ США | 8802-936 | для подачи увлажненного воздуха |
| 50-кратный объектив | Olympus Shinjuku, Токио, Япония | LMPLFL50X | записывающая установка |
| Clampfit 10 | Molecular Devices Sunnyvale, CA США | Ver. 10.4 | программное обеспечение для анализа спайков |
| Игорь Про 6 | WaveMetrics Озеро Освего ИЛИ США | Версия 6.37 | программное обеспечение для анализа данных |
| Аудиомонитор | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY США | NPIEXB-AUDIS-08B | Звуковые отчеты об отдельных всплесках |
| Внеклеточный усилитель | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY США | NPIEXT-02F | для увеличения амплитуды электрических сигналов |
| Контроллер клапана | Warner Instruments | VC-8 | для управления открытием клапана для стимуляции запаха |
| Записывающий электрод Микроманипулятор | Sutter Instruments Novato CA США | MP-285 | для позиционирования записывающего электрода |
| Усилитель головной сцены | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY США | EQ-16.0008 | для увеличения амплитуды электрических сигналов |
| Осциллограф | Tektronix Beaverton ИЛИ США | TDS2000C | Визуальный отчет об отдельных всплесках |
Ссылки
- Lin, H. -H., et al. Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success. Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Silbering, A. F., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
