Protokoll für die Festphasensynthese von Oligomeren der RNA mit einem 2&#39;-<em&gt; O</em&gt; -thiophenylmethyl-Modifikation und Charakterisierung über Kreisdichroismus

Andrew J. Francis; Marino J. E. Resendiz

doi:10.3791/56189

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Methodenartikel

Protokoll für die Festphasensynthese von Oligomeren der RNA mit einem 2'-

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DOI:

10.3791/56189

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28. Juli 2017

Andrew J. Francis¹ , Marino J. E. Resendiz¹

¹Department of Chemistry, University of Colorado Denver

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel liefert ein detailliertes Verfahren zur Festphasensynthese, -reinigung und -charakterisierung von an der C2'- O- Position modifizierten Dodecamern von RNA. UV-vis- und zirkuläre Dichroismus-photometrische Analysen dienen zur Quantifizierung und Charakterisierung von Strukturaspekten, dh Einzelsträngen oder Doppelsträngen.

Zusammenfassung

Die Festphasensynthese wurde verwendet, um kanonische und modifizierte Polymere von Nukleinsäuren, insbesondere von DNA oder RNA, zu erhalten, die es zu einer populären Methodik für Anwendungen in verschiedenen Bereichen und für verschiedene Forschungszwecke gemacht hat. Das hier beschriebene Verfahren konzentriert sich auf die Synthese, Reinigung und Charakterisierung von Dodecamern von RNA 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3' mit null, einer oder zwei Modifikationen, die sich an der C2'- O- Position befinden. Die Sonden basieren auf 2-Thiophenylmethylgruppen, die über Standard-organische Synthese in RNA-Nukleotide eingebaut und über ihre jeweiligen Phosphoramidite in die entsprechenden Oligonukleotide eingeführt werden. Dieser Bericht nutzt die Phosphoramidit-Chemie über die vier kanonischen Nukleobasen (Uridin (U), Cytosin (C), Guanosin (G), Adenosin (A)) sowie 2-Thiophenylmethyl-funktionalisierte Nukleotide, modifiziert am 2'- O- Position; Allerdings ist die Methodik für eine große varDie im Laufe der Jahre entwickelt wurden. Die Oligonukleotide wurden auf einem kontrollierten Porenglas (CPG) -Träger, gefolgt von einer Spaltung aus dem Harz und einer Entschützung unter Standardbedingungen, dh einem Gemisch aus Ammoniak und Methylamin (AMA), gefolgt von Fluorwasserstoff / Triethylamin / N-Methylpyrrolidinon, synthetisiert. Die entsprechenden Oligonukleotide wurden über Polyacrylamid-Elektrophorese (20% Denaturierung) gereinigt, gefolgt von Elution, Entsalzung und Isolierung über Umkehrphasenchromatographie (Sep-pak, C _18- Säule). Quantifizierungs- und Strukturparameter wurden mittels Ultraviolett-sichtbare (UV-vis) bzw. zirkuläre Dichroismus (CD) photometrische Analyse beurteilt. Dieser Bericht zielt darauf ab, als Ressource und Führer für Anfänger und Experten Forscher interessiert, um in diesem Bereich zu dienen dienen. Es wird erwartet, dass es als ein work-in-progress dienen, wie neue Technologien und Methoden entwickelt werden. Die Beschreibung der Methoden und Techniken innerhalb von ThiS Dokument entspricht einem DNA / RNA Synthesizer (renoviert und im Jahr 2013 gekauft), der Phosphoramidit Chemie verwendet.

Einleitung

Die Festphasensynthese zur Gewinnung von Oligonukleotiden von DNA / RNA ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das seit den 1970er Jahren ¹ ^, ² ^, ^{3 mit} Hilfe von Phosphoramidit-Bausteinen ⁴ verschiedene Anwendungen in verschiedenen Bereichen bedient hat. Beispiele für seinen breiten Einfluss sind: ihre Auswirkungen auf die Etikettierung ( über Klick-Chemie-Reaktionen) ⁵ , strukturelle Sondierung ⁶ und Antisense-Technologien ⁷ sowie die Aufklärung der biologischen Mechanismen ....