Мы описываем метод измерения активации Fc опосредованной эффекторных функций антителами, предназначенных гемагглютинина вируса гриппа. Этот assay также может быть адаптирована для оценки способности моноклональных антител или поликлональных сыворотки против других вирусных поверхностных гликопротеинов побудить Fc опосредованный иммунитет.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Метод оценки Fc опосредованной эффекторных функций, вызванных гриппа гемагглютинин специфические антитела
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Антитела играют решающую роль в муфты врожденного и адаптивного иммунного ответа против вирусных патогенов через их антиген связывания доменов и Fc регионы. Здесь мы опишем, как измерить активации ФК эффекторных функций моноклональные антитела против гемагглютинина вируса гриппа с использованием генетически Jurkat клеточной линии, выразив активации типа 1 Fc-с помощью этого метода, FcγR. вклад специфических взаимодействий Fc-FcγR, предоставленных иммуноглобулины могут быть определены с помощью assay в пробирке .
Введение
Иммунитет, предоставляемый вакцины против сезонного гриппа традиционно были оценены гемагглютинации ингибирование (HI) пробирного1, который измеряет наличие антител, которые целевой сайт связывания рецептора гемагглютинина. Эти Привет активные антитела могут наделять стерилизации иммунитет, но обычно узкие в их масштабы защиты, предоставляя иммунитет к только выбрать несколько штаммов вируса гриппа. Выделение и характеристика широко реактивной моноклональных антител, которые признают гемагглютинина (HA) предлагаю развития универсальной вакцины от гриппа в пределах досягаемости2,3,<....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Эксперименты, предварительно отформованных в этой рукописи были сделаны следующие Icahn школы медицины в институциональных кодекс этики и правил.
1. выражение гемагглютинина вируса гриппа через Transfection или инфекции
Трансфекция:
- Пластина человеческих эмбриональных почек (ГЭС 293T) клетки на плотности 2 х 104 клетки/хорошо в белой культуры ткани лечение 96-луночных пластины и дайте ему сидеть в течение 4 ч в инкубаторе 37 °C (с 5% CO2).
- Transfect клетки с 100 нг ДНК кодирования для вирусных гемагглютинин и 0,2 мкл Реагента трансфекции ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мы продемонстрировали, что стебель конкретных МАБ, 6F12, но не голова конкретных конкретного головы МАБ, PY102, смогла активировать первичной естественных клеток-киллеров по upregulating CD107a и интерферона гамма19. Для моделирования стебель специфические антитела способность активировать первичных человеческих НК-клеток, мы показываем, что стебель конкретных МАБ, 6F12, энергично можно активировать модифицированных клеток Jurkat, выражая мышиных FcγRIV, ~ четырнадцатикратное. С другой стороны рук.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Метод, описанный здесь позволяет измерить ха специфических моноклональных антител способность привлекать мышиных FcγRIV. Цель антигена, гемагглютинина вируса гриппа, выражается на поверхности клеток после заражения вирусом или трансфекции плазмидной ДНК. Assay далее поддается с использованием различных вирусных белков, поверхность выразил в сочетании с другими FcγRs (людей или Мурина). Кроме того, мы использовали образцы сыворотки для оценки способности в контекст поликлональных антител побудить ФК эффекторных функций (д.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.
Благодарности
Этот проект частично финансируется с федеральных средств от национального института аллергии и инфекционных болезней, национальные институты здравоохранения, Департамент здравоохранения и социальных служб, под CEIRS договора P01AI097092-04S1 (P.E.L.).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Ячейки А549 | ATCC | CCL-185 | Аденокарциномные альвеолярные базальные эпителиальные клетки человека |
| HEK 293T клетки | ATCC | CRL-3216 | Эмбриональные клетки почек человека |
| Липофектамин 2000 | Life Technologies | 11668019 | Реагент для трансфекции |
| 1X Opti-MEM Восстановленная сыворотка Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | |
| Культура белых тканей обработана 96-луночным | планшетом Corning, Inc. | 3917 | Планшеты |
| для анализа 10X MEM | Gibco | 11430-030 | |
| Jurkat cell экспрессирующие мышиные клетки FcgRIV | Promega | M1201 | Набор включает клетки, систему анализа Bio-Glo Luciferasese, 1X RPMI и сыворотку с низким уровнем IgG |
| Jurkat cell экспрессирующую человеческий FcgRIIIa | Promega | G7010 | Набор включает клетки, систему анализа Bio-Glo Luciferasese, 1X RPMI и сыворотку |
| с низким уровнем IgGНабор Jurkat cell экспрессирующий человеческий FcgRIIa | Promega | G9901 | включает в себя клетки, систему анализа Bio-Glo Luciferase, 1X RPMI и сыворотку с низким уровнем IgG |
| Люминометр BioTek | Synergy H1 Multi-Mode | Reader Люминесцентный планшет Система | |
| анализа Bio-Glo Luciferase Promega | G7940 | Содержит буфер для анализа люциферазы и субстрат анализа люциферазы | |
| Клетки | почек собак Madin DarbyATCC | CCL-34 | Клетки почек собак |
Ссылки
- Hobson, D., Curry, R. L., Beare, A. S., Ward-Gardner, A. The role of serum haemagglutination-inhibiting antibody in protection against challenge infection with influenza A2 and B viruses. J Hygiene. 70 (04), 767-777 (1972).
- Throsby, M., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
