我们描述了一种将流式细胞术与高通量测序相结合的技术，用于鉴定基因组中晚期复制的区域。
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本文内容
摘要
摘要
已开发出多种技术用于追踪DNA复制在细胞周期S期中的进程。其中大多数技术主要致力于阐明基因组复制起始的位置和时间，而非复制完成的过程。然而，了解基因组中最后完成复制的区域至关重要，因为这些区域更容易发生染色体断裂和突变，并且与疾病及衰老密切相关。本文介绍了我们如何改进一种原本用于监测复制起始的技术，以识别基因组中最后完成复制的区域。该方法结合了流式细胞术和高通量测序技术。尽管本报告重点描述该技术在酵母中的应用，但该方法可适用于任何能够根据DNA含量通过流式细胞仪进行分选的细胞。
引言
真核生物基因组的复制起始于多个离散位点，称为复制起点，从这些位点出发，复制叉向两个方向延伸（参见Fragkos et al., 20151的综述）。复制起点在激活的时间和效率上各不相同，为此已发展出多种技术用于监测复制起点的活性，并揭示这种差异的成因。单个复制起点的活性可通过检测单链DNA的水平2来推断，因为单链DNA会在活跃的复制起点周围形成；也可通过二维凝胶电泳技术监测特定的复制中间产物3，上述两种方法均可使用放射性探针进行检测。由于在S. cerevisiae中复制起点局限于特定的已知序列，因此这两种技术在该酵母中的应用比在哺乳动物细胞中更为简便。随着微阵列技术的出现，人们得以在全基因组范围内评估复制起点的激活情况。最初的方法是用重同位素标记DNA，将细胞从G1期阻滞中释放至含有轻同位素的培养基中，随后监测全基因组范围内重-轻杂合DNA的形成4。高通量测序技术的引入使得无需昂贵的同位素标记即可实现对复制起点活性的全基因组监测。通过流式细胞仪根据DNA含量对细胞进行分选，并对其DNA进行深度测序。由于在S期过程中序列覆盖度从1x逐步增加到2x，因此可通过比较S期细胞与G1期或G2期细胞的测序读段深度来评估相对复制时间5,
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方案
1. 流式细胞分选的细胞准备
- 将酵母接种于含有8 mL YEPD液体培养基的15 mL试管中，使过夜培养后菌液浓度达到每毫升5 × 106 至1.5 × 107 个细胞（参见讨论部分注释1）。
- 在15 mL带螺帽的离心管中，于室温或4 °C条件下以1,400 × g离心5分钟，沉淀酵母细胞；用1.5 mL 70%乙醇重悬细胞，转移至1.6 mL微量离心管中，室温静置1小时，或冰上静置至少3小时（可在4 °C长期保存）（参见讨论部分第(2)点）。
- 在微量离心机中以14,000 × g、4 °C离心1分钟，沉淀细胞；用1 mL pH 7.2的50 mM柠檬酸钠缓冲液重悬细胞，再次以14,000 × g、4 °C离心1分钟；吸除上清液后，用含0.25 mg/mL RNase溶液的1 mL pH 7.2的50 mM柠檬酸钠缓冲液重悬细胞，于50 °C加热块或水浴中孵育1小时，或于37 °C过夜孵育。
- 加入50 µL蛋白酶K溶液（20 mg/mL，溶于10 mM Tris pH 7.5、2 mM CaCl2、50% w/v甘油），于50 °C孵育1小时。
- 以14,000 × g、4 °C离心沉淀细胞，用1 mL pH 7.2的50 mM柠檬酸钠缓冲液重悬细胞，再次以14,000 × g、4 °C离心；用真空泵吸除上清液后，用1 mL溶于pH 7.2的50 mM柠檬酸钠缓冲液....
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结果
我们已采用上述方法鉴定出芽殖酵母中复制较晚的位点。利用人工染色体上已知的复制晚期区域对该方法进行测试，结果证明该技术准确且可靠。我们的研究结果还揭示了复制过程适时完成的重要生物学意义：在7号染色体上，我们根据G2-seq结果鉴定出的一个复制晚期区域，其丢失频率比相应的对照区域高出约三倍11。
G2-seq 结果的一个具体示例如 图2 所示。我们曾假设，在缺乏一种称为 Sir2 的蛋白质去乙酰化酶的细胞中，基因组中某些区域会特别晚进行复制。图2A 展示了野生型（蓝色）和 sir2 突变型（红色）数据处理的逐步过程。原始数据（上方行）包含大量尖峰，其中大多数是由于 Ty 元件的存在所致。通过将每个样本的测序深度限制在其中位数的 2.5 倍以内，可去除这些尖峰（中间行）。去尖.......
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讨论
尽管该技术具有较强的稳健性且相对简单直接，但仍需特别注意以下事项：
(1) 我们建议培养物在达到对数生长期前至少培养12小时，因为如果在接种后仅4小时达到目标密度即收获培养物，细胞周期分布会出现差异。我们的假设是，细胞周期分布达到相对稳定的平衡状态时，更能代表一个 "真实" 对数期分布比将饱和培养物较晚转移至新鲜培养基时仍处于动态变化的分布更为稳定。
（2）固定细胞时，无需先将细胞离心沉淀，也可直接向酵母培养物中加入100%乙醇，使乙醇的终浓度为70%。细胞可在合成培养基或丰富培养基（YEPD）中培养。
（3）通过绘制细胞数量与530 nm发射光面积的关系图，可对细胞周期各时相进行可视化以实现分选。我们发现，G1期与S期之间以及S期与G2期之间的拐点可作为界定S期的可靠标志，而我们将G2期信号峰值用作划分早期G2和晚期G2的边界。为表述清晰和简洁，我们使用"早期G2"和"晚期G2"的术语，尽管从技术上讲，细胞在完成DNA复制.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）GM117446基金对A.B.的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| YeaStar 基因组 DNA 试剂盒 | Genesee Scientific | 11-323 | |
| 1 µM SYTOX Green | ThermoFisher | 57020 | 用 50 mM 柠檬酸钠（pH 7.2）重悬 |
| 50 mM 柠檬酸钠，pH 7.2 | |||
| RNase 溶液（0.25 mg / mL） | Sigma | R6513 | 将 0.25 mg / mL RNaseA 重悬于 50 mM 柠檬酸钠（pH 7.2）中，首次使用前煮沸 10 分钟，之后储存于 -20° |
| 蛋白酶 K 溶液（20 mg / mL） | ThermoFisher / Invitrogen | 25530-015 | 用 10 mM Tris（pH 7.5）、2 mM CaCl₂、50% 甘油重悬，储存于 -20°C |
| Model 50 超声破碎仪 | Fisher Scientific | FB50A220 | |
| BD 生物科学 FACSAria II | BD Biosciences | 644832 | |
| Zymo-spin III 离心柱 | Zymo Research | C1005 | |
| Qubit dsDNA HS 检测试剂盒 | ThermoFisher | Q32851 | |
| Qubit 3.0 荧光计 | ThermoFisher | Q33216 | |
| Covaris Model LE220 专注式超声破碎仪 | Covaris | 500219 | |
| Illumina TruSeq DNA LT 样品制备试剂盒 | Illumina | 15026486 | |
| Illumina HiSeq 2500 测序仪 | Illumina | SY–401–2501 | |
| gsnap 比对软件 | 开源软件 / Genentech | http://research-pub.gene.com/gmap |
参考文献
- Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. DNA replication origin activation in space and time. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).
- Santocanale, C., Diffley, J. F. A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication. Na....
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