Method Article

Изготовления и проверки системы орган на чипе с интегрированной электроды непосредственно поддается трансэндотелиальной электрическое сопротивление

DOI:

10.3791/56334

⸱

September 26th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1BIOS Lab on a Chip group, MIRA Institute for Biomedical Technology and Technical Medicine, MESA+ Institute for Nanotechnology and Max Planck Center for Complex Fluid Dynamics, University of Twente, 2Microsystems, Eindhoven University of Technology, 3Applied Stem Cell Technologies, MIRA Institute for Biomedical Technology and Technical Medicine, University of Twente

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это издание описывает изготовление орган на чипе устройства с интегрированной электродами для прямого количественного определения трансэндотелиальной электрического сопротивления (Тир). Для проверки blood - brain барьер был подражал внутри этого microfluidic устройства и контролировать ее барьерные функции. Представленные методы интеграции электрода и прямой ТЕЕР количественной оценки обычно применяются.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Органов на чипов, в пробирке модели с участием культуры ткани (человека) внутри microfluidic приборы, являются быстро возникающих и обещание предоставить полезные исследования инструменты для изучения человеческого здоровья и болезни. Характеризовать барьерной функции слоев клеток, культивированный внутри устройства орган на чипе, измеряется часто трансэндотелиальной или transepithelial электрическое сопротивление (Тир). С этой целью электродов обычно интегрированы в чип микрообработка методами, чтобы обеспечить более стабильные измерения, чем достигается с ручной вставки электродов в отверстия чипа. Однако эти электроды часто препятствуют визуальный осмотр слоя клеток изучены или требуют дорогих чистых процессов для изготовления. Чтобы преодолеть эти ограничения, устройство, описанное здесь содержит четыре легко интегрируется электродов, которые размещаются и фиксированной вне области культуры, возможность визуального осмотра. Используя эти четыре электрода, что сопротивление шести путей измерения может быть определена количественно, из которого ТЕЕР могут быть непосредственно изолированы, независимо от сопротивления микроканалов заполненные питательной среды. Blood - brain барьер был повторен в это устройство и его ТЕЕР контролируется Показать устройства применимость. Этот чип, интегрированный электродов и метод определения ТЕЕР обычно применяются в органы на фишки, чтобы имитировать других органов или быть включены в существующие системы орган на чипе.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Органов на чипы быстро становится новым и перспективным класса в vitro ткани модели. 1 в этих моделях, клетки культивировали внутри microfluidic приборы, которые разработаны таким образом, что они имитируют физиологические микроокружения этих клеток. 1 , 2 это приводит к более реалистичным физиологических и патологических поведение этих клеток, чем можно ожидать от обычных в vitro модели простой дизайн и основные функции. 3 , 5 , 6 Кроме того, органы на чипы обеспечивают более управляемой среде, чем в естественных условиях модели и может включать здоровые и больные ткани от человеческого происхождения для точно повторяют человеческой физиологии и патологии. Недавно кратко успехи в развитии крови – мозг барьеров на микросхемах (BBBs на чипов) показывают, что поле является быстро двигаться вперед. 7

Еще одним преимуществом органов на чипов является, что они позволяют в реальном времени и непрерывный мониторинг ткани, культивированный внутри устройства, микроскопия, он-лайн биохимические анализы и интегрированных датчиков. 1 , 2 например, измерения электрического сопротивления трансэндотелиальной или transepithelial (ТЕЕР) является мощным методом для мониторинга неинвазивно развитие и нарушение формирования барьера тканей. 8 , 9 , 10 ТЕЕР электрическое сопротивление через сотовый барьер и поэтому свидетельствует о целостности барьер и проницаемости. 10 в органы на фишки, клеточных барьеров являются обычно выращиваются на мембрану, разделяющую два аэрогидродинамических каналы, представляющие апикальной и базолатеральной отсеков ткани, что барьер. В таких чипов ТЕЕР измерения могут проводиться удобно с электродами, вставляется в впуски и выпуски двух каналов. 3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 однако, руководство вставки и реинтеграции электродов может легко привести в размещение ошибки и таким образом вариации в измеренного сопротивления как например различия в сопротивление длиннее или короче пути через микроканалов являются значительным по сравнению с сопротивление клетки барьер. 16 для устранения ошибки реинтеграции, устройств с интегрированной электроды были предложены. Однако, большинство этих комплексных электродов блокировать мнение при осмотре культуры ткани17,18,19,20,21 и/или требуют специализированных Cleanroom процессы для изготовления. 17 , 22

Орган на чипе устройства, описанные в настоящем издании, впервые применена в более ранние публикации,16 сочетает в себе устойчивость комплексной электродов с видимость слоя измеряемой клеток и легко изготовления. Проектирование и изготовление чип изображен на рисунке 1. Короче говоря, это устройство состоит из двух частей полидиметилсилоксан (PDMS) с отметками канала, которые связаны вместе бесплатно утечки с мембраной из поликарбоната с 0,4 мкм поры между ними. Четыре провода платины электроды вставляются и фиксированной на место с стеклоиономерным клей хорошо вне области культуры. Все эти шаги производства могут проводиться с Общелабораторное оборудование, без необходимости для чистых помещений среды. Помимо этого, можно сделать шесть измерений импеданса с использованием этих четырех электродов, тем самым позволяя прямой изоляции измеренных ТЕЕР, независимо от сопротивления микроканалов до поперечного сечения и таким образом свести к минимуму влияние -биологические вариации в системе, такие как (пере) ошибки вставки. 16

Чтобы показать применимость этого устройства и прямые измерения ТЕЕР, гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) была воспроизведена в этот чип. Эта биологическая барьер состоит из специализированных эндотелиальных клеток и регулирует транспорт между кровью и мозг для обеспечения гомеостаза головного мозга. 23 , 24 для имитации BBB, верхний канал microfluidic устройства был выстроен с человеческого мозга микрососудистой эндотелиальных клеток от линии hCMEC/D3 клеток (любезно предоставил д -р P.-O. Couraud, INSERM, Париж, Франция). 25 представлен метод, однако, более вообще применимо к любому устройству орган на чипе с двумя отсеками, позволяя ТЕЕР определения с помощью легко интегрированы электродов.

В этой рукописи сначала описан процесс изготовления устройства орган на чипе с интегрированной электродов. Далее, посева процедуры и культуры эндотелиальных клеток мозга внутри устройства объясняется, а также на чипе ТЕЕР измерения. В разделе результаты представителя ТЕЕР измерений показываются и уточнить обработки данных. Наконец представлен барьерной функции BBB-на чипе, наблюдение в течение 3 дней, показаны применимость представленных устройств и методов для мониторинга ТЕЕР.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Изготовление устройства орган на чипе

  1. делать PDMS реплики плесени с канала конструкций, изготовленных с использованием методов стандартных фотолитографии и получать PDMS части microfluidic чипа.
    1. Весят примерно 27 g PDMS базовый агент и 2.7 g отвердителя; массовое соотношение должно быть 10:1. Это хорошо для PDMS плиты толщиной 3 мм на форму с диаметром 130 мм (5 дюймов). Эти компоненты перемешать.
    2. Смесь в эксикатор для приблизительно 45 мин для удаления пузырьков воздуха Дега.
    3. Тем временем подготовить формы для жидкой смеси PDMS придерживаясь четких ленту вокруг плесени или место плесень в держатель подходящий вафельные.
    4. Залить дегазацию PDMS смесь на плесень. Если любые воздушные пузыри оставался в PDMS смеси или на поверхности формы, Дега его снова для приблизительно 30 мин
    5. Вылечить PDMS смесь в духовке при 60 ° C в течение 4 ч. разрешить охладить вниз.
    6. В поперечно проточные вытяжки, тянуть вылечить PDMS от плесени; плесень может использоваться сразу же сделать более реплики PDMS.
    7. Нарезать PDMS реплики верхней и нижней частей чип с использованием линии резки в PDMS.
    8. Удар четыре отверстия в верхней части с помощью удар резкий биопсии с диаметром 1 мм до формы впуски и выпуски. Удар от внутри к внешним для предотвращения PDMS мусора от сбора в чипе. Покрытие части чип с прозрачной клейкой ленты, чтобы защитить их от пыли.
    9. Разрезать поликарбоната мембран из Transwell вставки на квадраты примерно 3 × 3 мм 2.
  2. Сборка, пористые мембраны бесплатно утечки между двумя частями PDMS для того, чтобы собрать устройство двухслойная сопряжена с пористые мембраны.
    Примечание: Этот протокол адаптирована из Griep и др. 19 и неточна и др. 26
    1. подготовить раствором PDMS/толуола, используя 0,7 г PDMS базовый агент, 0,07 g отвердителя и 540 мкл толуола, что привело в соотношении 5:3 вес. Вихревой раствор тщательно.
    2. Спин пальто 200 мкл раствора на coverslip стекла на 1500 об/мин для 60 s (увеличивается на 1000 об/мин/сек) для приобретения тонкий, равномерный слой раствора.
    3. Передача тонкий слой раствора с coverslip на нижней и верхней частью чип с чернилами ролика. Поместить в нижней части в духовке Сейф блюдо.
    4. С набор пинцетов окунуть края мембраны в спин покрытием минометов и поместите его тщательно в середине нижней части.
    5. Тщательно место верхней части в нижней части при уделении внимания выравнивание.
      Примечание: Не оказывают давления на чип и не слайд верхней части в нижней части для предотвращения раствора попадание каналы и засорения мембран.
    6. Обложка входы микросхемы с прозрачной клейкой ленты для предотвращения пыли от ввода чип и испечь их на 60 ° C в течение 3 ч.
  3. Интегрировать электродов в боковые каналы.
    Примечание: Этот протокол адаптирована из Griep и др. 19 и Дувиль и др. 18
    1. сократить провода платины на куски из примерно 2 см. чистота, погрузив их в ацетон для 30 минут промыть водой и этанола и дайте высохнуть.
    2. В поперечно проточные вытяжки, поставить чип на пластиковые блюдо. Вставьте четыре провода платины в каналы электрода чипа, используя пинцет и согнуть их вниз на пластиковых блюдо для фиксации на блюдо на последующем шаге. Подключите провода 0,7-1 мм в канал Культура, мимо перекрестка Т-образный канал.
    3. Применить капли УФ отверждаемыми клея на входе канала электрода и разрешить клей для заполнения канала вокруг электрода, капиллярных сил.
    4. Включение УФ и лечения клей, когда он достигает конца электрода канала.
      Осторожностью: Не смотрите на источник ультрафиолетового света, как это может повредить ваши глаза.
    5. Фиксировать четыре комплексных электродов для пластиковых блюдо с Двухкомпонентный эпоксидный клей. Это позволяет легче обработки электродов во время измерений без риска потянув электродов от чипа.
    6. Покрытия чипсы с прозрачной клейкой ленты и выпекать их при 60 ° C в течение 2 ч. Дайте остыть и хранить пыли до использования. Таким образом они могут быть безопасно хранятся до месяца,.

2. Культуры эндотелиальных клеток мозга, полученных на чипе

  1. пальто фишки содействие ячейки вложение.
    1. Заполнения обоих каналов с фосфатом буферизации физраствора (PBS) намочить их до введения реагентов. Проверьте под микроскопом, если есть любые пузыри воздуха в каналах. Если это так, удалите их, перемещая с дополнительной PBS.
    2. Заполнить оба канала с 30 мкл 20 мкг/мл человека фибронектин в PBS. Инкубируйте 3 часа при 37 ° C. Проверить наличие пузырьков воздуха и, при необходимости, очистить каналы с PBS и заправка раствором фибронектин.
    3. Flush чипсы с эндотелиальной роста среднего и инкубировать их при 37 ° C и 5% CO 2 в инкубаторе для 2 h.
    4. Измерения ТЕЕР пустой чипов, как описано в шаге 3, чтобы обеспечить, что все электроды находятся в непосредственном контакте с жидкостью в каналах. В пустой чипов, типичный ТЕЕР значениями являются 0-1 Ω см 2.
  2. Семян клетки в верхний канал.
    1. Удалить питательной среды от культуры колбу (зона культуры 2 75 см) с вырожденная монослоя человеческого мозга микрососудистой эндотелиальных клеток (hCMEC/D3).
    2. Мыть ячейки с PBS. Добавить 2 мл 0,05% трипсина-ЭДТА и инкубировать при 37 ° C и 5% CO 2 на 2-5 минут до тех пор, пока клетки отделены от культуры колбу и.
    3. Отключить трипсина с питательной среды, дополнены 20% плода бычьим сывороточным (ФБС). Подсчитать количество ячеек и рассчитать общее количество клеток в суспензии.
    4. Тем временем, центрифуга hCMEC/D3 клетки на 390 g x 5 минут и удалить супернатант.
    5. Ресуспензируйте Пелле клеток в соответствующий объем среднего роста эндотелия (ЭГМ-2) приехать в концентрации 5 х 10 6 клеток/мл. Это приводит к посевной плотность 2 x 10 5 клеток/см 2 в чипе.
    6. Медленно Пипетка 30 мкл суспензии перемешанных клеток в верхний канал и удаления пипеткой из входе в свободно движение по-прежнему оказывают давление.
    7. Проверить плотность посева под микроскопом. Должно быть достигнуто равномерное распределение клеток на протяжении верхний канал.
    8. Фишки при 37 ° C и 5% CO 2 для по крайней мере 1 h. вымывать любой не вложенные ячейки с эндотелиальной культуры среднего инкубировать.
  3. Поддерживать культуру на чипе эндотелия.
    1. Дважды в день, вставить заполненные питательной среды наконечники как водохранилищ в бухтах и заменить тяжести управляемый поток среды внутри чипа.
      Примечание: Чтобы избежать воздушных пузырей попадание микроканалов и разрушения слоя клеток, не забудьте сделать жидкость жидкость контакт между кончиком пипетки и жидкости на вершине чип перед вставкой кончик в входе. Это может способствовать, добавив небольшое падение на в / выход до вставки пипеткой.
    2. Также добавить водохранилищ наконечник пипетки в точках, чтобы предотвратить высыхание каналы.
    3. Инкубировать фишки при 37 ° C и 5% CO 2.

3. Встроенное ТЕЕР измерения

  1. создана the ТЕЕР измерения аппарат, состоящий из блокировки в усилитель и цепи кабеля датчика, как было указано в Ван дер шлем и др. 16 Кроме того, Потенциостаты или импеданса анализаторы подходят также для этих измерений на основе импеданс ТЕЕР.
  2. Принять чип от инкубатора и позволяют ему достичь комнатной температуры для по крайней мере 10 минут удалить любой жидкости из пластиковых блюдо вокруг электродов для предотвращения электрода преодоление вне чип.
  3. Принять импеданс спектра от 200 Гц до 1 МГц для каждой комбинации двух электродов, повлекшие 6 спектров импеданса на чип в только 5-10 минут проверить если спектров импеданса ожидаемой величины и формы для проверки ТЕЕР измерения, как описано в разделе результаты.
  4. Поставить чип обратно в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO 2 после окончания измерения.
  5. Процесс полученные импеданс спектры прибыть в нормализованное значение ТЕЕР.
    1. Получить измеренного сопротивления figure-protocol-1 между электродами figure-protocol-2 и figure-protocol-3, как обозначено в Рисунок 2B и D, с резистивным плато на 10 кГц в соответствующих спектров импеданса.
    2. Расчет с использованием шести измеряемых сопротивлений, соответствует один чип в одно время ТЕЕР точки с помощью уравнения Рисунок 2 g 16:
      figure-protocol-4
      в это уравнение, figure-protocol-5 область культуры, через который был измеряется сопротивление, < img alt =» Уравнение 5» src="/files/ftp_upload/56334/56334eq5.jpg» / > сопротивление сотовой барьера и мембраны, figure-protocol-6, figure-protocol-7, figure-protocol-8 и figure-protocol-9 являются сопротивление значения, измеренные через сотовый барьер и figure-protocol-10 и figure-protocol-11 значения сопротивления измеряются в прямые каналы. 16 уравнение является производным от эквивалентной схемы, показано на рисунке 2 c.
  6. Вычесть пустой ТЕЕР от ТЕЕР во всех точках времени получить развитие ТЕЕР вовремя.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Схематические результаты Электроимпедансная спектроскопии через чип без клетки (сплошная линия) и клеточных барьер (пунктирная линия) приведены на рисунке 2A. Можно выделить четыре основных регионов, каждый преобладают конкретные электрических компонентов. Ниже примерно 1 кГц двойной слой емкость на интерфейсе средний электрод культура доминирует, характеризуется отрицательный наклон для величины сопротивления и фазовый сдвиг, приближается к-90 °. Частота, на которой доминирует двойной слой емкости, зависит от площади электрода, подвергается питательной среды. Резистивный плато над 1 кГц (без клетки) или 100 кГц (с клетками) со сдвигом фазы близок к 0 °, соответствует к сопротивлению питательной среды внутри microfluidic каналов, в зависимости от длины канала и площадь поперечного сечения и внутри мембрана, в зависимости от пористости и толщины. При измерении через сотовый барьер, а также локального максимума в фасы диаграм рассматривается загородный резистивный плато между 1 и 10 кГц. Этот регион имеет решающее значение для определения ТЕЕР как четкое увеличение сопротивления результаты когда клетки присутствуют в измеренные пути и поэтому называется «регион интерес». Дополнительные склон между 10 и 100 кГц соответствует ячейке Емкость барьера, который возникает из электроизоляционное липидного бислоя мембраны и зависит от общей площади слоя клеток. 27 границы этих регионов, а также сопротивление величины зависят от системы изучаются и изменить с, среди прочего, размеры канала, проводимость питательной среды, положение электрода и тип ячейки. Для дальнейшего чтения по теории и практике Электроимпедансная спектроскопии на барьер формирование тканей рекомендуется обзор статьи Бенсон и др . 28

Репрезентативных данных измерений ТЕЕР отображается пустой чип и чип с слоем эндотелиальных клеток мозга hCMEC/D3 в рисунке 2E и 2F, соответственно. Короче говоря, импедансной спектроскопии была выполнена с использованием шести измерениям с четырьмя электродами: два измерения каналам культуры среднего заполненные ячейки (сплошные линии) и четыре измерения через каналы, а также мембраны и - при наличии - Сотовый барьер (пунктирные линии). Эти шесть измерений пути могут быть определены в эквивалентные резистивной цепи Рисунок 2B, который является производным от схема поперечного сечения (рис. 2 c) и вид сверху (Рисунок 2D). Пустой чип измерения (Рисунок 2E) показывают типичные формы спектров импеданса без ячеек, как показано на рисунке 2А. Измерения через сотовый барьер (пунктирные линии в рисунке 2F) напоминают типичные импеданс спектры с клетки на рисунке 2A. Обратите внимание, что импеданс величина и фаза сдвиг увеличение на 1 МГц. Это типичный ответ установки измерения на высоких частотах и не экспериментальной происхождения.

Чтобы определить ТЕЕР, используя эти экспериментальные импеданс спектры, сначала измеренных чип сопротивление определяется, который является общее сопротивление слоя клеток, каналов и мембраны. С этой целью был выбран подходящий индикация частоты в регионе интереса, который в локального максимума в фазе сюжет с клетками и близко к 0 ° сдвиг фазы без клетки: 10 кГц. С шести измеряемых сопротивлений на 10 кГц измеряемый между четырьмя электродами, ТЕЕР непосредственно рассчитывается с помощью уравнения в рисунке 2F.

Чтобы показать, что представленные устройство подходит для определения ТЕЕР органов на чипов, BBB был реплицирован внутри чипа и его ТЕЕР наблюдали в течение 3 дней культуры. На рисунке 3A показано средняя ТЕЕР ± Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM) для четырех BBBs на чипов, что приводит к плато 22 ± 1,3 Ω см2, которая сопоставима с ТЕЕР этой клеточной линии, как сообщалось в литературе. 29 Кроме того, после окончания эксперимента и флуоресценции окрашивания ядер, то можно увидеть что мозг эндотелия образуется непрерывная монослоя внутри устройства (рис. 3B). Иммунофлюоресценции пятнать туго Джанкшен белка Zonula Occludens-1 (ZO-1) показал, что эндотелиальных клеток мозга поддерживали их BBB-конкретных фенотипа и сформирован плотный соединительной комплексов.

figure-results-1
Рисунок 1: Проектирование и монтаж устройства орган на чипе с интегрированной электродов.
(A) взорвался мнению microfluidic чипа, состоящий из верхней части PDMS с верхний канал (TC), мембрана (M) и нижней части PDMS с нижней канал (до н.э.). Четыре провода платины электродов (E1-4) вставляются и исправлена в боковые каналы. В верхней канале и на вершине мембраны эндотелиальные клетки мозга hCMEC/D3 были культивированный реплицировать BBB. (B) собрал чип, который крепится к пластиковой блюдо. Переиздание и адаптирован с разрешение от Elsevier. 16 пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Представитель импеданс данных и определение ТЕЕР.
(A) схема импеданс спектра показаны импеданс величины (Ω) и фазовый сдвиг (°) по сравнению с частоты (Гц), типичные для спектроскопии Электроимпедансная фишки без клетки (сплошная линия) и с клетками (пунктирная линия). Существует четыре основных регионов, каждый преобладают: двойной слой емкость на электроды, питательной среды сопротивление, сопротивление клетки барьер и емкость клеточной мембраны. «Региона интерес» указывает, где вклад слоя клеток могут быть количественные (красная стрелка). (B) эквивалент резистивной цепи чипа, показаны верхний канал резисторы R1 и R3, дно канала резисторы R2 и R4 и мембраны и EC барьер резистор Rm. (C) схематическое сечение показаны эндотелиальных клеток (EC) культивировали в на верхний канал. (D) Схематический вид сверху BBB чип показаны конфигурации электродов и культуры области 0,25 мм2 через который измеряется сопротивление. (E) представитель импеданс спектры пустой чипа заполнены с клеток питательной среды. (F) представитель импеданс спектры чип в которой hCMEC/D3 мозг эндотелиальные клетки были культуры в течение 3 дней. (G) формула для вычисления ТЕЕР от измеренного сопротивления между всех шести комбинации четырех электродов. Переиздание и адаптирован с разрешение от Elsevier. 16 , пожалуйста, нажмите здесь для просмотра больших versИон этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Представитель ТЕЕР развитие BBB-на чипе.
(A) средняя ТЕЕР ± Среднеквадратичная ошибка среднего (SEM) четыре BBBs на чипов культуры течение трех дней, достигая плато (средняя ± SEM) 22 ± 1,3 Ω см2 . Для сравнения данные пустым чипов включена, показывая маргинальных вариации и отклонение от 0 Ω см2 за тот же период, по сравнению с вариации и ТЕЕР стоимости чипов с ячейками. (B) микроскопии флуоресцирования окрашенных ядер показала непрерывный монослоя эндотелия, как по PDMS мембраны в местоположение, указанное врезные. (C) иммунофлюоресценции выявили наличие жесткой перехода белка Zonula Occludens-1, указывая, что BBB-конкретных плотные соединения между ячейками породить измеренных ТЕЕР. Переиздание и адаптирован с разрешение от Elsevier. 16 пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой рукописи были представлены инженерные устройства орган на чипе и непосредственного определения трансэндотелиальной электрического сопротивления (ТЕЕР) сотовых барьера, культивируемых в устройстве. Представленным методом интеграции электроды без оборудования чистых помещений и непосредственного определения ТЕЕР, используя четыре электрода применима к любой орган на чипе устройства с двумя отсеками microfluidic. Чип макет и геометрии могут быть адаптированы в соответствии с требованиями предусмотрено экспериментов, как четыре электрода отделены в двух отсеков. Четыре электрода может даже быть удобно вставлен в бухтах существующих чипов, при том условии, что они помешаны на месте в течение шести измерениям. Утечки Бесплатная связь метод могут быть оптимизированы для различных мембран и геометрии канала, изменяя соотношение PDMS/толуола. Более высокое содержание толуол приводит тоньше спин покрытием слой раствора26 и может быть более подходящим для резкости и узкие каналы в частях PDMS. Нижняя толуол контента результаты в толще mortar слой26 и может быть более подходящим подложить толще мембраны между частями PDMS.

Как можно увидеть в схематических импеданс спектры в рисунке 2A и экспериментальные спектры в рисунке 2E и 2F, измерения импеданса находятся под влиянием двойной слой емкость на интерфейсе электрод средний. Из-за небольшого размера электродов внутри микроканалов двойной слой емкость может доминировать над плато резистивный сотовой барьера в спектров импеданса, осложняющих количественная оценка ТЕЕР. Чтобы преодолеть это, могут быть вставлены электроды дальше в культуре каналы до фиксации. Это позволит увеличить площадь поверхности электрода подвергаются питательной среды и с этим емкость двойной слой будет увеличиваться также. Это приводит к сдвиг емкостным склона для низких частот, так что резистивный плато сотовой барьер может быть более легко признанных и количественные. Хотя сопротивление измеренных путь между двумя электродами станет меньше, это не будет влиять ТЕЕР количественной оценки представленных метода.

Во время измерения через сотовый барьер, вполне возможно, что загородный резистивный плато не могут быть признаны. Это может быть результатом аэрогидродинамических соединения между двумя каналами, например если мембрана плохо окружен раствор, приводит к измеренной путь вокруг сотовой барьер. Кроме того может существовать электрические преодоление вне чип, если электроды соединены капли питательной среды. Это обычно сочетается с нижней измеренное сопротивление и может быть решена путем удаления этот мост питательной среды. Наконец если существует не резистивный плато и измеренное сопротивление порядков выше, чем ожидалось, может быть свободно подключение электропроводки или в источнике питания.

В будущем физиологические актуальности текущей BBB-на чипе может быть увеличен путем разоблачения эндотелиальных клеток для сдвига стресс на физиологическом уровне, который сообщается содействовать BBB дифференциации и увеличение герметичности барьер и трудно достичь в обычных в vitro моделей. 29 Кроме того, дно канала представлены устройства обеспечивает подходящую отсек для клеток мозга, полученных совместно культивируемых с эндотелия. Это также ожидается увеличение функцию барьера, а также позволяет изучение сложных взаимодействий между типы соответствующих клеток в патологических условиях. 29

В заключение орган на чипе устройства, описанные в настоящем издании могут быть изготовлены с использованием стандартного лабораторного оборудования и показано для предоставления прямых измерений ТЕЕР, используя четыре комплексных электроды, не препятствующих визуальный осмотр изучал ячейки слой. Применимость этого устройства в поле органов на чипов была продемонстрирована подражая BBB в этот чип и мониторинга ТЕЕР период культуры. Целый ряд других органов (барьер) можно имитировать, включая другие типы соответствующих клеток в этот чип. Кроме того метод для измерения ТЕЕР может легко применяться в других двух устройств на базе купе орган на чипе прибыть на воспроизводимость и значимые ТЕЕР значений, которые можно сравнить с устройствами и системами.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы с благодарностью признаем Johan Бомер для изготовления формы и Mathijs собственности для плодотворных дискуссий и помощь с представлением данных.

Это исследование финансировалось: СРО биомедицинских микроприборов л.и. Segerink, MIRA института биомедицинской инженерии и технические медицины, Университет Твенте; СРО органов на чипов, а.д. ван дер Меер, мира институт биомедицинской инженерии и технические медицины, Университет Твенте; и VESCEL, передовых грантов ЕИС к а. ван ден Берг (Грант № 669768).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<сильно>Материалы
Полидиметилсилоксан (PDMS) Базовый агент и отвердитель: Sylgard 184 Набор силиконовых эластомеровDow Corning1673921
Scotch Magic тейп3M
Биопсийный перфоратор, диаметр 1,0 ммIntegra Miltex33-31AA-P/25
Поликарбонатная мембрана, 0,4 &; m размер порCorning3401Вырез из культуральных вставок Transwell
ТолуолSigma-Aldrich244511
Платиновая проволока, 200 &; m диаметр AlfaAesar10287
УФ-отверждаемый клей: Norland Optical Adhesive 81Norland ProductsNOA 81
Эпоксидный клей: Loctite M-31 CL HysolHenkel30673
hCMEC/D3 клеткиЛиния микрососудистых эндотелиальных клеток головного мозга человека, любезно предоставленная доктором.-О. Couraud, INSERM, Paris, France
Фосфатно-солевой буфер (PBS)SigmaP4417
Фибронектин плазмы человека, 20 & микро; г/млGibco33016015
Эндотелиальная среда роста-2 (EGM-2)LonzaCC-3162Эндотелиальная базальная среда-2 (EBM-2) с добавлением EGM-2 SingleQuots
Trypsin-EDTA, 0,05%Gibco15400-054
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Gibco26140-079
NameCompany Каталожный номер<strong>Комментарии
Оборудование
ПечьСвязующее9010-0190
Spin Coater: Spin 150PolosSPIN150-NPP
источник ультрафиолетового излучения, 365 нм в течение 5 с при 350 мВт/см2Изготовлено на собственном производстве
Центрифуга: Центрифуга Allegra X-12R BeckmanCoulter
IncubatorBinder CB E2 150
BoxenseLocSenseLock-in усилитель с кабельной цепью зонда, специализированный для измерений TEER на кристалле
hCMEC/D3

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).">Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
  2. Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse. Integr Biol. 4 (5), 461-470 (2012).">Van der Meer, A. D., Van den Berg, A. Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse. Integr Biol. 4 (5), 461-470 (2012).
  3. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).">Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  4. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).">Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
  5. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol. 5 (9), 1130-1140 (2013).">Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol. 5 (9), 1130-1140 (2013).
  6. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (4), 1357-1362 (2013).">Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (4), 1357-1362 (2013).
  7. Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research. Tissue barriers. 4 (1), e1142493(2016).">Van der Helm, M. W., Van der Meer, A. D., Eijkel, J. C., Van den Berg, A., Segerink, L. I. Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research. Tissue barriers. 4 (1), e1142493(2016).
  8. Drug Delivery to the Brain Vol. 10 AAPS Advances in the Pharmaceutical Sciences Series. Hammarlund-Udenaes, M., de Lange, E., Thorne, R. G. , Springer. New York. 163-197 (2014).">Abbott, N. J., Dolman, D. M., Yusof, S., Reichel, A. Chapter 6. Drug Delivery to the Brain Vol. 10 AAPS Advances in the Pharmaceutical Sciences Series. Hammarlund-Udenaes, M., de Lange, E., Thorne, R. G. , Springer. New York. 163-197 (2014).
  9. Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems. Lab Chip. 15 (3), 745-752 (2015).">Odijk, M., et al. Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems. Lab Chip. 15 (3), 745-752 (2015).
  10. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).">Srinivasan, B., et al. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  11. Recreating blood-brain barrier physiology and structure on chip: A novel neurovascular microfluidic bioreactor. Biomicrofluidics. 9 (5), 054124(2015).">Brown, J. A., et al. Recreating blood-brain barrier physiology and structure on chip: A novel neurovascular microfluidic bioreactor. Biomicrofluidics. 9 (5), 054124(2015).
  12. A Novel Dynamic Neonatal Blood-Brain Barrier on a Chip. PLoS ONE. 10 (11), e0142725(2015).">Deosarkar, S. P., et al. A Novel Dynamic Neonatal Blood-Brain Barrier on a Chip. PLoS ONE. 10 (11), e0142725(2015).
  13. A microfluidic bioreactor with integrated transepithelial electrical resistance (TEER) measurement electrodes for evaluation of renal epithelial cells. Biotechnol bioeng. 107 (4), 707-716 (2010).">Ferrell, N., et al. A microfluidic bioreactor with integrated transepithelial electrical resistance (TEER) measurement electrodes for evaluation of renal epithelial cells. Biotechnol bioeng. 107 (4), 707-716 (2010).
  14. Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis. Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).">Kilic, O., et al. Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis. Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).
  15. Mechanical stress regulates transport in a compliant 3D model of the blood-brain barrier. Biomaterials. 115, 30-39 (2017).">Partyka, P. P., et al. Mechanical stress regulates transport in a compliant 3D model of the blood-brain barrier. Biomaterials. 115, 30-39 (2017).
  16. Direct quantification of transendothelial electrical resistance in organs-on-chips. Biosens Bioelectr. 85, 924-929 (2016).">Van der Helm, M. W., et al. Direct quantification of transendothelial electrical resistance in organs-on-chips. Biosens Bioelectr. 85, 924-929 (2016).
  17. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (mu BBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).">Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (mu BBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  18. Fabrication of two-layered channel system with embedded electrodes to measure resistance across epithelial and endothelial barriers. Anal chemi. 82 (6), 2505-2511 (2010).">Douville, N. J., et al. Fabrication of two-layered channel system with embedded electrodes to measure resistance across epithelial and endothelial barriers. Anal chemi. 82 (6), 2505-2511 (2010).
  19. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).">Griep, L. M., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  20. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnol Bioeng. , (2016).">Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnol Bioeng. , (2016).
  21. Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood–Brain Barrier. Mol Pharm. 13 (3), 895-906 (2016).">Wang, J. D., Khafagy, E. -S., Khanafer, K., Takayama, S., El Sayed, M. E. H. Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood–Brain Barrier. Mol Pharm. 13 (3), 895-906 (2016).
  22. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sens Actuators B Chem. 222, 1209-1219 (2016).">Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sens Actuators B Chem. 222, 1209-1219 (2016).
  23. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).">Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
  24. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).">Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).
  25. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).">Weksler, B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  26. Leakage-free bonding of porous membranes into layered microfluidic array systems. Anal chem. 79 (9), 3504-3508 (2007).">Chueh, B. -H., et al. Leakage-free bonding of porous membranes into layered microfluidic array systems. Anal chem. 79 (9), 3504-3508 (2007).
  27. Encyclopedia of Computational Neuroscience. Jaeger, D., Jung, R. , Springer. New York. 555-558 (2015).">Golowasch, J., Nadim, F. Encyclopedia of Computational Neuroscience. Jaeger, D., Jung, R. , Springer. New York. 555-558 (2015).
  28. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids Barriers CNS. 10 (5), (2013).">Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids Barriers CNS. 10 (5), (2013).
  29. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16(2013).">Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. -O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16(2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Organ on ChipTransendothelial Electrical ResistanceIntegrated ElectrodesBlood Brain BarrierTEER MeasurementPDMS FabricationMicrofluidic ChipsCell Barrier FunctionImpedance SpectroscopyPlatinum Electrodes

Related Articles