والهدف من هذا البروتوكول هو علامة على وجه التحديد وعزل الحمض النووي الفيروسي من الخلايا المصابة لتحديد خصائص البروتينات الفيروسية الجينوم المرتبطة بشكل انتقائي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تنقية الحمض النووي الفيروسي للتعرف على البروتينات الفيروسية والخلوية المرتبطة بها
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
والهدف من هذا البروتوكول هو عزل فيروس الحلأ البسيط من النوع 1 (هامبورغ-1) الحمض النووي من الخلايا المصابة لتحديد المرتبطة الفيروسية والبروتينات الخلوية بالكتلة قياس الطيف الكتلي. على الرغم من أن البروتينات التي تتفاعل مع الجينوم الفيروسي تضطلع بأدوار رئيسية في تحديد نتيجة العدوى، تحليلاً شاملا للبروتينات الفيروسية الجينوم المرتبطة لم يكن ممكناً سابقا. هنا نظهر أسلوب يتيح لتنقية مباشرة من هامبورغ-1 مورثات من الخلايا المصابة. تكرار الحمض النووي الفيروسي هو المسمى بشكل انتقائي مع تعديل النيوكليوتيدات التي تحتوي على مجموعة وظيفية ألكاين. الحمض النووي المسمى هو ثم على وجه التحديد ولا رجعة فيه معلم عن طريق إلحاق التساهمية أزيد البيوتين عن طريق لنحاس (I)-حفز أزيد-ألكاين سيكلواديتيون أو انقر فوق رد. هو تنقية الحمض النووي معلم البيوتين في الخرز المغلفة ستريبتافيدين والبروتينات المرتبطة التيد وحددها الكتلي. يتيح هذا الأسلوب بالاستهداف الانتقائي والعزلة من هامبورغ-1 النسخ المتماثل شوك أو الجينوم كله من البيئات البيولوجية المعقدة. وعلاوة على ذلك، سوف تسمح التكيف مع هذا النهج للتحقيق في الجوانب المختلفة للإصابة هيربيسفيرال، فضلا عن فحص مورثات فيروسات الحمض النووي الأخرى.
المقدمة
فيروسات لديها قدرة محدودة على الاضطلاع بالمهام الأساسية، وذلك يعتمد على عوامل المضيف لتسهيل الجوانب الحرجة للإصابة بما في ذلك التعبير المورثات الفيروسية والنسخ المتماثل، إصلاح، وممارسو والنقل. وكثيراً ما تزاد أنشطة هذه العوامل المضيفة بالبروتينات المرمزة فيروسي. وبالإضافة إلى ذلك، يجب تجنب الفيروسات الكشف والتدخل بالاستجابات الخلوية للعدوى الفيروسية. ولذلك، تملي التفاعلات المضيف الفيروس نتيجة الإصابة. من الأهمية بمكان هو فهم كيفية تغير فيروسات البيئة الخلوية تكييف الآلية الخلوية لتسهيل عمليات الفيروسية. أهمية خاصة هو تحديد العوامل والعمليات التي تعمل على الجينوم الفيروسي طوال دورة المعدية.
فيروس الحلأ البسيط من النوع 1 (هامبورغ-1) هو مزدوج ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-خلية ثقافة والعدوى الفيروسية، ووسم الصادرات ( الشكل 1)
البروتوكول التالي ينطوي على العمل مع الفيروسات. يرجى الرجوع إلى المؤسسة الخاصة بك ' s بروتوكولات السلامة البيولوجية فيما يتعلق بالمناولة الآمنة للفيروسات وغيرها من العناصر البيولوجية. هذا البروتوكول كان أقرها "المجلس الاستعراض المؤسسي" لجامعة بيتسبرغ.
- تريبسينيزي المتلاقية 150 سم 2 زراعة الأنسجة قارورة من الخلايا لجنة نهر الميكونج-5 ونقل الخلايا إلى 2 سم 600 لوحة زراعة الأنسجة التي تحتوي على 100 مل دميم بالإضافة إلى 10% FBS. احتضان عند 37 درجة مئوية حضور 5% CO 2 لمدة 3-4 أيام للوصول إلى مرحلة كونفلوينسي وثاب....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وأنجز استخدام الكيمياء انقر لتنقية الحمض النووي من الخلايا أولاً ب أسلوب إيبوند21. وغرض إيبوند لتنقية شوك الخلوية النسخ المتماثل للتعرف على البروتينات المرتبطة بها. أننا قد تكيفت هذه التقنية لدراسة تفاعلات البروتين فدنا على وجه التحديد أثناء الإصابة. التلاعب بالنهج المتبع في التسمية الجينوم الفيروسي مع تنمية الصادرات (الشكل 1)، جنبا إلى جنب مع العدوى المتزامنة، سمح للعزل الانتقائي والتحقيق من السكان منفصلة من فدنا. هامبورغ-1 "الحمض الن.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ويشمل هذا البروتوكول العديد من الخطوات التي، إذا لم تتبع بدقة، يمكن أن يؤدي إنتاج البروتين انخفاضا كبيرا أو تلوث بالحمض الخلوي. من الأهمية بمكان أن يتم استخدام الخلايا ثابتة لجميع التجارب لضمان أن الحمض الخلوي لا المسمى وتنقيته. هذا يمكن تأكيد عدم وجود بولمرس الحمض الخلوي في العينة البروتين لأن هامبورغ-1 لا تستخدم بوليميريز الحمض الخلوي لتركيب الجينوم. خلال تنمية الصادرات وسم ونوى حصاد الخطوات، ينبغي متداخلة العينات التأكد من أن يتم معالجة كل منهما على قدم المساواة. خلال خطوات تنقية، ينبغي الحرص لا للتلاعب بنوي من بيبيتي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
ونعترف هانا فوكس للحصول على مساعدة في إعداد هذه المخطوطة. أيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة منح R01AI030612.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| خلايا MRC-5 | ATCC | CCL-171 | |
| مصل الأبقار الجنينية (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-082 | تم استبداله ب 10٪ FBS ، 2 ملي مولار L-glutamine ، 12 mM & nbsp ؛ (للنمو في القوارير) أو 30 ملي مولار (للنمو في الأطباق) الصوديوم وثنائي الكربنات |
| 600 سم 2< / sup> طبق زراعة الأنسجة | Thermo Fisher Scientific | 166508 | |
| Tris Buffered Saline (TBS) ، درجة الحموضة 7.4 | 137 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي كلوريد كلوريد ، 491 ملي مللي كلوريد ، 680 ملي كلوريد المكالسيوم ، 25.1 ملي من مخزون تريسين | ||
| HSV-1 | الأسهم ذات العيارات أكبر من 1x109< / sup> PFU / مل تعمل بشكل أفضل | ||
| Sephadex G-25 عمود (عمود تحلية المياه PD-10) GE | Healthcare | 17085101 | |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) | فيشر Scientific | D128-1 | |
| 5 & حاد ؛ -Ethynyl-2 & حاد ؛ -deoxycytidine (EdC) | Sigma-Aldrich | T511307 | يذوب في DMSO لتحضير مخزون 40 ملي مولار ، وتخزينه عند -20 درجة ؛ ج |
| 2 & حاد ؛ ديوكسي سيتيدين (deoxyC) | Sigma-Aldrich | D3897 | يذوب في الماء لتحضير 40 ملي من المرق ، aliquot ، وتخزينه عند -20 درجة ؛ ج |
| مخزن الاستخراج النووي (NEB) | تحضير طازج (20 ملي مولار هيبس الرقم الهيدروجيني 7.2 ، 50 ملي كلوريد الصوديوم ، 3 ملي مللي ملليجرام كلوريد < > 2 < / فرعي > ، 300 ملي مولار سكروز ، 0.5٪ إيجيبال) | ||
| مكشطة الخلية | زجاج بيلكو | 7731-22000 | الأوتوكلاف قبل الاستخدام |
| محلول تريبان الأزرق | سيجما ألدريتش | T8154 | |
| PBS ، درجة الحموضة 7.2 (10x) | 1.37 م كلوريد الصوديوم ، 27 ملي كلوريد الصوديوم ، 100 ملي أمبير Na2< / sub>HPO4< / sub> ، 18 ملي مولار KH2< / sub>PO4< / sub> (يخفف إلى 1x في ماء معقم قبل الاستخدام) | ||
| كبريتات النحاس (II) خماسي هيدرات (CuSO4-5H2O) فيشر | Scientific | C489 | تحضير مخزون 100 ملي وتخزينه عند 4 درجات ؛ C لمدة تصل إلى شهر |
| واحد (+) L-ascorbate الصوديوم | Sigma-Aldrich | A4034 | تحضير مخزون 100 ملي من المرق حديثا وتخزينه على الثلج حتى استخدام |
| البيوتين أزيد | Invitrogen | B10184 | قم بإعداد 10 ملي مخزون في DMSO ، aliquot ، وتخزينه عند -20 درجة ؛ C لمدة تصل إلى 1 سنة |
| انقر فوق مزيج | تحضير مباشرة قبل الاستخدام عن طريق إضافة الكواشف بالترتيب المشار إليه (10 مل: 8.8 مل 1x PBS ، 200 مل 100 مل CuSO4< / sub> ، 25 مل 10 ملي بيوتين أزيد ، 1 مل 100 ملي أسكوربات الصوديوم) ؛ | ||
| كوكتيل روتشي مثبط البروتياز | الكامل 11697498001 | يذوب في 1 مل من الماء لتحضير مخزون 50x ، ويمكن تخزينه في 4 درجات ؛ C لمدة تصل إلى أسبوع واحد ، أو أضف مباشرة حبة واحدة إلى 50 مل عازلة | |
| تجميد المخزن | تحضير طازجة (7 مل 100٪ جلسرين ، 3 مل NEB ، 200 مو ؛ L 50x مثبط البروتياز) | ||
| Buffer B1 | تحضير طازج (25 ملي كلوريد الصوديوم ، 2 ملي EDTA ، 50 ملي Tris-HCl درجة الحموضة 8 ، 1٪ إيجبال ، 1x مثبط للبروتينات) | ||
| العازلة B2 | تحضير طازجة (150 ملي كلوريد الصوديوم ، 2 ملي EDTA ، 50 ملي ثلاثية حمض الهيدروكلوريك 8 ، 0.5٪ إيجبال ، 1 × مثبط للبروتياز) | ||
| العازلة B3 | تحضير طازجة (150 ملي كلوريد الصوديوم ، 2 ملي EDTA ، 50 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك 8 ، 1x مثبط البروتينات) | ||
| Vibra Cell Ultra Sonic Processer مجهز بمسبار microtip 3 مم | Sonics | VCX 130 | |
| مصفاة خلية | Falcon | 352360 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65601 | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| أنبوب صغير دوار | فيشر Scientific | 260750F | |
| 2x Laemmli عينة عازلة | امزج 400 مجم من SDS ، 2 مل 100٪ جلسرين ، 1.25 مل من 1 M Tris (درجة الحموضة 6.8) ، و 10 مجم من البروموفينول الأزرق في 8 مل من الماء. يخزن في 4 ° C لمدة تصل إلى 6 أشهر. قبل الاستخدام ، أضف 1 M DTT إلى التركيز النهائي البالغ 200 مل. | ||
| أقفال غطاء لأنبوب 1.5 مل | فيشر Scientific | NC9679153 | |
| كواشف | |||
| NOVEX طقم تلطيخ أزرق غروي | Invitrogen | LC6025 | |
| طبق زراعة الأنسجة 12 بئر | Corning | 3513 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-100 | الأوتوكلاف قبل الاستخدام |
| شرائح المجهر | فيشر Scientific | 12-552-5 | |
| 16٪ بارافورمالديهايد | علوم المجهر الإلكتروني | 15710 | تمييع إلى 3.7٪ في 1x PBS قبل الاستخدام |
| ألبومين مصل البقر (BSA) | فيشر Scientific | BP1605 | تحضير 3٪ في 1x PBS |
| (0.5٪ Triton-X 100) | Sigma-Aldrich | T8787 | تحضير 0.5٪ Triton-X 100 في 1x PBS |
| انقر فوق كوكتيل التفاعل - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging | المجسات الجزيئية | C10337 | التحضير وفقا لبروتوكول manufactorer |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | تحضير 10 مجم / مل في الماء ، ويمكن تخزينه عند 4 درجات ؛ C لمدة تصل إلى 1 سنة |
| من الفأر المضاد للجسم المضاد الأساسي ل ICP8 | Abcam | ab20194 | استخدم تخفيف 1: 200 في 1x PBS |
| Mouse المضاد للجسم المضاد الأساسي UL42 (2H4) | Abcam | ab19311 | استخدم تخفيف 1: 200 في 1x PBS |
| Goat المضاد للفأر 594 مترافق | تقنيات الحياة | a11005 | استخدم تخفيف 1: 500 في 1x PBS |
| Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| SDS-bicarb | 2٪ SDS ، 200 ملي NaHCO3 | ||
| الفينول: الكلوروفورم: كحول | مزيج 25:24: 1 قبل يوم واحد على الأقل من الاستخدام ، يخزن في درجة حرارة 4 درجات ؛ C في | ||
| الكلوروفورم الداكن: كحول | امزج 24: 1 قبل يوم واحد على الأقل من الاستخدام ، وتخزينه في درجة حرارة الغرفة في الظلام | ||
| 10x Tris EDTA (TE) ، درجة الحموضة 8.0 | 100 ملي تريس ، 10 ملي مولار EDTA (خفف إلى 1x قبل الاستخدام) | ||
| طقم تنقية Qiaquick PCR | Qiagen | 28104 | |
| 3 M أسيتات الصوديوم درجة الحموضة 5.2 | |||
| كيوبت 2.0 مقياس الفلور | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| أنابيب فحص كيوبيت | Invitrogen | Q32856 | |
| مجهر مضان مجهز ببرنامج | |||
| جهاز طرد مركزي دقيق لأنابيب | |||
| جهاز طرد مركزي منضدية لأنابيب | |||
| حاضنة الثقافة خزانة | |||
| السلامة الحيوية | |||
| كتل | 65 درجة ؛ C و 95 درجة ؛ ج |
المراجع
- Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields virology. , 6th, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins Health. (2013).
- Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics. Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).
- Wagner, L. M., DeLuca, N. A.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
