אוכלוסיה מאוד טהור של megakaryocytes ניתן להשיג כבל דם-derived CD34+ תאים. שיטה CD34+ בידוד תאית התמיינות מגקריוציט מתואר כאן.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מגקריוציט בידול ויצירת טסית דם מן האדם כבל CD34 נגזר דם תאים+
במאמר זה
סיכום
תקציר
ייצור טסיות מתרחשת בעיקר במח העצם על תהליך המכונה thrombopoiesis. במהלך thrombopoiesis, להבדיל hematopoietic ובתאים כדי מבשרי טסיות טופס שנקרא megakaryocytes, אשר להבדיל סופני לשחרר טסיות דם מן התהליכים זמן cytoplasmic כינה proplatelets. Megakaryocytes הם נדירים תאים מוגבל במח העצם, ולכן הם קשים לקצור או מספיקים לשימוש מעבדה. ייצור יעיל של megakaryocytes האנושית יכולה להיות מושגת במבחנה מאת culturing CD34+ תאים בתנאים מתאימים. פרוטוקול מפורט כאן מתאר בידוד של CD34+ תאים על-ידי תא מגנטי מיון של דגימות דם חבל הטבור. מתוארים הצעדים הדרושים כדי לייצר megakaryocytes מאוד טהור, בוגרת בתנאים ללא סרום. הפרטים של ניתוח פנוטיפי של בידול מגקריוציט והנחישות של היווצרות proplatelet וייצור טסיות הינם גם מסופקים. ניתן להוסיף effectors המשפיעים על בידול מגקריוציט ו/או היווצרות proplatelet, כגון נוגדנים נגד טסיות או מימטיקה thrombopoietin, תאים בתרבית לבחון תפקוד ביולוגי.
מבוא
בידוד של מספרים נאותה של ראשי megakaryocytes האנושית (ח"כ) לשימוש מעבדה רגיל הוא לא ריאלי עקב שלהם בתדר נמוך במח העצם, שבו הם מהווים ~0.01% של תאים nucleated1. חלופה נוחה היא הרחבה שמחוץ הבידול של גזע hematopoietic, ובתאים בנוכחות גורמי גדילה ספציפי. מספר של ציטוקינים כולל גורם לתאי גזע (SCF; ליגנד c-kit), אינטרלויקין (IL)-3 ו- IL-11 היו מועסקים במערכות תרבות לייצר מק ש. Thrombopoietin (TPO) היא הגורם היעיל ביותר בהתפתחותם עבור תרבויות megakaryocytic הוא יעיל לבד או עם אחרים ציטוקינים, כגון SCF ו- IL-32. TPO יכול לפעול על תאי גזע אוכלוסיות את התוצאה התפשטות וגם ההבשלה של חברי כנסת2.
<....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
פרוטוקול זה אושר על ידי דרום מזרח סידני האנושי מחקר ועדת האתיקה, שאושררה על-ידי ועדת האתיקה של המחקר האנושי של האוניברסיטה של ניו סאות וויילס. דם טבורי שהושג מתורמים בריאים סופק על ידי סידני בנק דם טבורי (NSW, סידני, אוסטרליה). כרכים של 100 מ ל שימשו עבור הליך זה.
הערה: עבודה ב- cabinet באמצעות הטכניקה aseptic Class II אבטחה. Decontaminate החיצוני של שקית הדם טבורי עם 70% אתנול. להשתמש בכלים סטריליים (מספריים, פינצטה) עבור הליך זה.
1. כבל תאי הדם הכנה ובידוד של CD34 תאים+
- להכין את ההפרדה סטרילי מאגר (SB) בתמיסת פוספט buffered (PBS), ב- pH 7.2, המכילה 0.5% שור אלבומין ו- 2 מ מ EDTA.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול זה מאפשר הכנת תרבויות ח"כ הטהור מאד מכבל דם-derived CD34+ תאים. האחוז של CD34+ תאים כבל דם הוא כ 1.3%15 (איור 1 א') ואת המספר הכולל של תאי תאי (שלב 1.8) נע בין 90-300 x 106 ליחידה UCB. טוהר CD34 + CD45 + תאים לאחר בידוד נעה בין 90 ל 99% (איור 1B). ח"כ (כהגדרתו CD41+ תאים) הם נצפו בתחילת CD34 ללא סרום+ תא תרבויות בנוכחות rhTPO. יום 7, האחוז של .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המתואר כאן מתאימה לייצור עקבית של ח"כ ולבנים וטסיות דם בתרבות של דם טבורי. תאים אלה ניתן ללמוד תהליכים שונים כגון ההשפעה של תרופות או פעילויות ביולוגיות על ח כ התפשטות, בידול, היווצרות proplatelet וייצור טסיות.
מגוון רחב של שילובים ציטוקין ומדיה תרבות הוצגו בספרות. תוספת של ציטוקינים כגון גורם לתאי גזע, Flt 3 ליגנד, IL-3 ו- IL-6 תומך CD34+ תא התפשטות. עם זאת, התרחבות זו התוצאה טוהר ח"כ מופחת ב תרבות14. השיטה המוצגת כאן, באמצעות מדיה ללא סרום rhTPO ל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים להכיר את התמיכה של בריאות אוסטרלי המועצה למחקר רפואי (פרויקט גרנט 1012409 קשורה BHC).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>ריאגנטים לתרבית תאים | |||
| רקומביננטי TPO אנושי | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | |
| StemSpan SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | מדיה נטולת סרום עבור תאי CD34+ |
| שם | חברה | Catalog Number | Comments |
| >CD34 Isolation Reagents | |||
| CD34 MicroBead kit ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | ערכה זו כוללת את המגיב חוסם IgG האנושי FcR ומיקרו-חרוזי CD34. חרוזים אלה מכילים את שיבוט הנוגדנים נגד CD34 QBEND/10. השתמש בשיבוט אחר נגד CD34 לבדיקת טוהר (למשל שיבוט 8G12). |
| Lymphoprep | Alere Technologies | 1114545 | אמצעי הפרדת לימפוציטים (צפיפות 1.077 גרם/מ"ל) |
| מאגר הפרדה סטרילי (SB) | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | מאגר זה מכיל תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS), pH 7.2 המכיל 0.5% אלבומין בסרום בקר ו-2 מ"מ EDTA. ניתן להכין אותו באמצעות רכיבים סטריליים בדרגת תרבית תאים. הסר גז לפני השימוש מכיוון שבועות אוויר עלולות לחסום את העמוד. |
| name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flow Cytometry and Cell Staining Reagents | |||
| PE עכבר אנטי-אנושי CD34 | BD Biosciences | 340669 | Clone 8G12. זה יכול לשמש לבדיקת טוהר CD34. ריכוז הנוגדנים הסופי דילול 1:10. |
| עכבר PerCP אנטי אנושי CD45 | BD Biosciences | 347464 דילול 1:10 | |
| בקרת איזוטיפ PerCP BD | Biosciences | 349044 | דילול 1:10 |
| FITC עכבר אנטי אנושי CD41a | BD Biosciences | 340929 | דילול ריכוז נוגדנים סופי 1:5. |
| APC Mouse אנטי-אנושי CD42b | BD Biosciences | 551061 | נוגדן זה יכול לשמש גם לאיתור MK בוגר (אחוז התאים החיוביים בדרך כלל נמוך יותר מאשר עם אנטי CD42a). ריכוז הנוגדנים הסופי דילול 1:10. |
| Alexa Fluor 647 Mouse Anti-Human CD42a | AbD Serotec | MCA1227A647T | מופץ כיום על ידי Bio-Rad. ריכוז הנוגדנים הסופי דילול 1:10. |
| Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control | AbD Serotec | MCA928A647 | מופץ כיום על ידי Bio-Rad. נוגדן בקרת איזוטיפ |
| אנטי פון ווילברנד גורם ארנב פוליקלונלי | Abcam | AB6994 | 1:200 דילול |
| V450 עכבר אנטי הומנה CD41a | BD Biosciences | 58425 | 1: 20 דילול |
| V450 בקרת איזוטיפ | BD Biosciences | 580373 | 1:20 דילול |
| PAC1-FITC נוגדן BD | Biosciences | 340507 | דילול 1:10 |
| עכבר אנטי CD62p חד שבטי | Abcam | AB6632 | 1:200 דילול |
| Alexa Fluor 488 עז אנטי ארנב IgG | Invitrogen | A11008 | 1:100 דילול |
| Alexa Fluor 594 עז אנטי עכבר IgG | Invitrogen | A11020 | 1:100 דילול |
| Ig Isotype Control קוקטייל-C | BD Biosciences | 558659 | נוגדן לבקרת איזוטיפ |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
| CountBright חרוזי ספירה מוחלטת | בדיקות מולקולריות, Invitrogen | C36950 | ספירת חרוזים |
| <חזק>שם | <חזק>חברה | <חזק>מספר קטלוגי | <חזק>הערות |
| <חזק>חומרים | |||
| עמודות LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | עמודים קטנים וגדולים יותר זמינים גם מסחרית |
| מגנט מפריד MidiMACS | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Falcon 5 מ"ל צינורות FACS מפוליפרופילן תחתון עגול, עם מכסה הצמד, טכנולוגיות סטריליות | במבחנה | 352063 | |
| שקופיות | זכוכיתמדיית הרכבה של Menzel-Glaser | J3800AMNZ | |
| עם מדיום הרכבה DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Antifade עם DAPI |
| strong>שם | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| מיקרוסקופ הפוך | Leica | DMIRB מיקרוסקופ | |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי | Zeiss | Vert.A1 | |
| מנתח תאים | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| צנטריפוגה ציטוספין | ThermoScientific | Cytospin 4 | |
| Name | >Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Cell analyzer software | BD Biosciences | FACS Diva תוכנה | |
| לניתוח תאים בודדים | Tree Star | FlowJo | |
| תוכנת מיקרוסקופ פלואורסצנטי | Zeiss | Zen 2 blue edition |
מקורות
- Nakeff, A., Maat, B. Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation. Blood. 43 (4), 591-595 (1974).
- Zeigler, F. C., et al. In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-m....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
