꼬마 선 충 나이 연구 변화 내재 단백질 집계에 방법

요약

여기에 제시 된 방법의 목표는 단백질 집계 모델 유기 체 C. 선 충에서 정상적인 노화 과정을 탐구. 프로토콜 나이 형성 하는 매우 불용 성 큰 집계를 공부 하 고 proteostasis에 변화 단백질 집계에 미치는 영향을 결정 하는 강력한 도구를 나타냅니다.

초록

마지막 십 년간에서 Alzheimer의 질병 (광고) 등 파 킨 슨 병 (PD), 신경 장애의 보급은 성장 했다. 이 나이 관련 무질서는이 환자의 두뇌에 있는 fibrillary 구조 단백질의 모양 특징. 일반적으로 수용 성 단백질을 받을 이유는 정확 하 게 집계 프로세스를 제대로 이해 남아 있습니다. 발견 단백질 집계 질병 프로세스에 국한 되지 않습니다 정상적인 노화 과정의 일부 단백질 집계, ectopically를 사용 하지 않고 조절 분자 및 세포 메커니즘의 연구를 활성화 하는 대신 인간의 표현 질병 관련 단백질입니다. 여기는 상호 보완적인 접근 방식을 통해 꼬마 선 충 에서 고유의 단백질 집계를 검토 하는 방법론에 설명 합니다. 첫째, 우리 세 동물을 얻을 나이 동기화 C. 선 충 의 많은 성장 하는 방법을 검토 하 고 우리는 매우 불용 성-큰 집계 분리 하 생 화 확 적인 절차를 제시. 대상된 유전 최저와 함께, 그것은 홍보 또는 양이 많은 질량 분석 어느 포괄적인 분석을 사용 하 여 연령에 따라 단백질 집계 방지에 관심사의 유전자의 역할을 해 부 수 또는 후보-기반 항 체와 분석입니다. 이러한 결과 다음 형광 태그 집계 하기 쉬운 단백질을 표현 하는 유전자 변형 동물 vivo에서 분석에 의해 확인 됩니다. 이러한 메서드는 특정 단백질은 나 이와 함께 집계 및 궁극적으로 완전 한 기능이 단백질을 유지 하는 방법 하는 경향이 이유를 명확히 하는 데 도움이 됩니다.

서론

단백질 misfolding 및 집계 AD, PD, 루 경화 증 (ALS), frontotemporal 치 매 (FTD), 그리고 많은 다른 같은 여러 신경 퇴행 성 질환의 특징으로 인식 됩니다. 예를 들어, 녹말 체 소에 α-synuclein 어셈블리는 악화 모터 신경에 있는 양식 세포질 집계에 ALS 환자 TDP-43 또는 FUS misfold에 PD 환자의 substantia nigra에 특히 Lewy 몸으로 축적. 각 이러한 신경 퇴행 성 질환, 단백질 항상성 또는 proteostasis를 유지 하는 메커니즘 질병에 따라서 선도 misfolded 단백질의 축적을 방지 하기 위해 실패 합니다.

Proteostasis 세포 기능을 보장 하기 위해 중요 한 이며, 정상적인 조건 하에서 이러한 규제 메커니즘 단단히 단백질 합성, 접는, 그리고 성능 저하의 속도 제어 합니다. 여러 연구 결과 입증 노화, 수 많은 세포와 장기의 단백질 항상성 유지가 점차적으로 손상 된과 나이 proteostasis 네트워크의 생리 적 저하는에 대 한 중요 한 악화 요인 신경 퇴행 성 질병 (참조^1,2,3

프로토콜

참고: 절차의 더 나은 이해에 대 한 워크플로 (그림 1)의 회로도 연결 됩니다.

1. 영의 큰 숫자와 세 C. 선 충 의 성장 대상이 RNAi를 대상으로 관심의 유전자

참고: 사용 C. 선 충 살 균 온도 유도 gon-2(q388) 돌연변이 (CF2253) 큰 세 동기화 인구를. 모든 단계는 화로와 반 메 마른 조건 하에서 작동 하 고 아무 오염 균 류 또는 박테리아) (예를 들어와 있는지 확인이 중요 하다. 온도 설명 되지 않은 경우에 실 온에서 (또한 centrifugations) 단계를 수행 합니다.

1. 생식이 동물을 얻기 위해 C. 선 충 gon-2(-) 돌연변이 체의 준비
   참고: 무 균 동물 생식 선 부족을 얻으려면, 손실의 기능 돌연변이 해야 합니다 유도 될 부모 동물에 마지막 애벌레 단계 (L4)이 이동 하 여 25 ° C에 모성 기여를 피하기 위하여.
   1. 온도 변화에 대 한 부모의 세대 수집 gon-2(-) 동물의 첫 번째 확장
      1. 행진 대장균....

결과

우리가 사용 하는 방법 여기 어떻게 수명이 긴 동물을 평가 하 여 감소 IIS 변조 연령에 따라 단백질 집계. 서쪽으로 오 점 (단계를 참조 하십시오 2.2, 빨리 서쪽 오 점 분석에 대 한 불용 성 단백질 추출), 우리는 총 영 (성년의 날 3)의 불용 성 단백질 함량을 분석 (성년의 날 18) 웜 제어 RNAi와 RNAi는 인슐린을 대상으로 세 / IGF-1-같은 수용 체 daf-2. RNAi 조건 (그림 2A) 총 단백질 수준의 나이 또는 제어와 daf-2 사이 큰 변경 없이 관찰합니다. 예상 대로, 우리는 제어 동물 (그림 2B) 매우 불용 성 단백질의 수준에 강한 나이 관련 된 증가 감지. Daf-2 RNAi에 수명이 긴 동물에 비교, 집계 성향 크.......

토론

여기 우리는 매우 불용 성 단백질 질량 분석 및 서쪽 blotting에 의해 분석을 위한 RNAi를 받게 되는 선 충 C. 노화에서 집계를 분리 하는 방법을 보고 합니다. 우리는 그 연령에 따라 단백질 집계 방지 proteostasis IIS를 크게 줄임으로써 향상을 보여줍니다. 특정 집계 경향이 단백질 C. 선 충에서 overexpress을 선택 하 여 추가 고유의 단백질 집계를 변조 하는 메커니즘을 해 부 수는.

질병 관련 단백질 집계 대 고유의 연령에 따라 단백질 집계
이 현재 작업 단백질 집계는 질병의 맥락에서 집계 하는 특정 단백질을 제한 하는 이전 연구 결과 기반으로 합니다. Ectopically 표현된 질병 관련 단백질 보다는 내 생 집계 경향이 단백질에 집중 함으로써, 기대 집계 과정의 생리 규제에 새로운 통찰력을 제공 하는. 연령에 따라 단백질 집계는 서로 다른 세포 위치

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Fernbach 문화 플라스크	Corning	4425-2XL	Pyrex, 용량 2,800 ml, 3개의 배플 인덴트
포함 멤브레인 스크류 캡	Schott	1088655	GL45
Nutating Mixer	VWR	444-0148
분리 퍼넬	Nalgene	4300-1000	용량 1,000 ml
1 ml 주사기	BD Plastipak	300013
회색 바늘, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm	BD Microlance 3	300635
멤브레인 필터 0.025 &마이크로; M	Millipore	VSWP04700
pH 스트립	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14
프로테아제 억제제 칵테일	Roche	4693132001	완전한 미니 EDTA-무료 정제
옥톡시놀-9	Applichem	A1388	Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M1317
Nonylphenylpolyethylenglycol	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)
DNaseI	Roche	04716728001	재조합, RNase free
RNaseA	Promega	A7973	용액
총 단백질 블롯 염색	Thermofisher	S11791	Sypro Ruby 단백질 블롯 염색
총 단백질 겔 염색	Thermofisher	S12001	Sypro Ruby 단백질 겔 염색
TCEP (트리스 (2-카르복시에틸) 포스핀 염산염)	Serva	36970
요오드 아세트 아미드	Serva	26710
암모늄 바이 카보네이	시그마 - 알드리치	09830
기서열분석 등급 변형 Trypsin	Promega	V5111
등압 태그	Sciex	4352135	iTRAQ 시약 멀티플렉스 키트
원심분리기 Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	393126
Ultracentrifuge Optima Max-XP	Beckmann Coulter	393315
Centrifuge 5424R	Eppendorf
Centrifuge 5702	Eppendorf	5702000329
Centrifuge Megafuge 40R	Thermo Scientific	75004518
Concentrator Plus	Eppendorf	5305000304	Centrifugal ecentrator
형광 실체 현미경 M165 FC	라이카		플라나포 2.0x 대물
박부 해부 현미경	라이카		Leica S6E
고배율 현미경 Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		with PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis software	ImageJ
Analysis of mass spectrometry data Protein	Prospector
http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htmE.coli strain
OP50	CGC
RNAi bacteria
L4440	Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253	CGC, 균주 이름: EJ1158		유전자형: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214	DZNE Tü의 Della David의 연구실; bingen		유전자형: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]
DCD215	DZNE Tü의 Della David의 연구실; bingen		유전자형: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]

트 상대 및 절대 정량 분석을 위한 염5404000413