نقدم بروتوكولا لدقة قوانتيتاتي البروتينات مع وسمها isobaric، وتجزئة واسعة النطاق، والأدوات المعلوماتية الحيوية وخطوات مراقبة الجودة في تركيبة مع اللوني السائل موصول إلى مطياف كتلة ذات الدقة عالية.
قد بذلت العديد من أوجه التقدم الاستثنائي في الطيف الكتلي (مللي ثانية)-على أساس البروتيوميات، مع التقدم التقني خاصة في اللوني السائل (ش) بالإضافة إلى الترادف الطيف الكتلي (LC-MS/MS) والقدرات المتنوعة وضع العلامات إيسوباريك. وهنا، نقدم بروتوكول تنميط البروتيوميات عميق الذي يجمع بين 10-من نوع plex جنبا إلى جنب الشامل العلامة (TMT) وسم مع منصة LC/LC-MS/MS واسعة النطاق، وتصحيح مللي ثانية بعد انتهاء التدخل الحسابية دقة قوانتيتاتي بروتيوميس كله. هذا البروتوكول يشمل الخطوات الرئيسية التالية: استخراج البروتين والهضم ووسم الحديد، ثنائي الأبعاد (2D) LC، الكتلي عالية الاستبانة، وتجهيز البيانات الحسابية. يتم تضمين لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها وتقييم التباين التجريبية خطوات مراقبة الجودة. يمكن أن يكون كوانتيتاتيد 10,000 أكثر من البروتينات في عينات الثدييات ثقة مع هذا البروتوكول. يمكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول على كوانتيتاتيون التعديلات بعد متعدية مع تغييرات طفيفة. يوفر هذا الأسلوب متعدد وقوية هي أداة قوية لتحليل البروتين في مجموعة متنوعة من النماذج المعقدة، بما في ذلك زراعة الخلايا والأنسجة الحيوانية، والعينات السريرية البشرية.
التقدم في تكنولوجيا الجيل التالي تسلسل أدت إلى المشهد جديد لدراسة النظم البيولوجية والأمراض التي تصيب البشر. وقد أتاح هذا عدد كبير من القياسات للجينوم والترنسكربيتوم والبروتين، ميتابولومي، ونظم أخرى الجزيئية لتصبح ملموسة. الطيف الكتلي (MS) أحد الأساليب الأكثر حساسية في الكيمياء التحليلية، وتطبيقه في البروتيوميات وقد توسعت بسرعة بعد تسلسل الجينوم البشري. في ميدان البروتيوميات، السنوات القليلة الماضية قد أسفرت عن أوجه التقدم التقني الرئيسية في التحليلات الكمية على أساس مرض التصلب العصبي المتعدد، بما في ذلك العلامات إيسوباريك ومضاعفة القدرة جنبا إلى جنب مع واسعة النطاق اللوني السائل، بالإضافة إلى الأجهزة السلف، مما يسمح لقياسات أكثر دقة، وأسرع مع أقل مواد العينة المطلوبة. البروتيوميات الكمية أصبحت نهجاً التيار الرئيسي للتنميط عشرات الآلاف من البروتينات والتعديلات بوستترانسلاشونال في عينات بيولوجية معقدة للغاية1،2،،من34 , 5 , 6.
متعدد أساليب وصفها isobaric مثل العلامة إيسوباريك كوانتيتاتيون النسبية والمطلقة (أي، إيتراق) والعلامة الجماعية جنبا إلى جنب (TMT) مرض التصلب العصبي المتعدد إلى حد كبير تحسنت إنتاجية عينة وازداد عدد العينات التي يمكن تحليلها في واحد تجربة1،6،،من78. جنبا إلى جنب مع الأساليب الأخرى المستندة إلى MS كوانتيتيشن، مثل كوانتيتيشن خالية من التسمية والنظائر المستقرة وسم مع الأحماض الأمينية في الخلية والثقافة (أيسيلك)، إمكانيات هذه التقنيات في البروتيوميات هو ميدان كبير9 ،،من1011. على سبيل المثال، يسمح الأسلوب الحديد 10 البروتين عينات تحليلها معا في التجربة 1 باستخدام الكواشف 10-من نوع plex. هذه العلامات الحديد هيكلياً متطابقة الجماهيري العام نفسه، ولكن النظائر الثقيلة توزع الأثران على ذرات الكربون أو النيتروجين، أسفر عن أيون مراسل فريدة من نوعها خلال تجزئة MS/MS لكل علامة، وبالتالي تمكين كوانتيتاتيون النسبية بين العينات العشر. تطبيق هذه الاستراتيجية الحديد بشكل روتيني لدراسة الممرات البيولوجية وتطور المرض والعمليات الخلوية12،،من1314.
تحسينات تقنية كبيرة عززت النظم – MS/MS اللوني السائل (ش)، سواء من حيث فصل LC والمعلمات مرض التصلب العصبي المتعدد، إلى أقصى حد ممكن تحديد البروتين دون التضحية بدقة كوانتيتيشن. فصل البعد الأول من الببتيدات بأسلوب فصل مع تعامد عالية للبعد الثاني ضروري في هذا النوع من الأسلوب البروتيوميات بندقية لتحقيق أقصى قدر من النتائج20. درجة الحموضة عالية عكس المرحلة اللوني السائل (ربلك) يوفر أداء أفضل مما يفعل تبادل الأيونات الموجبة القوى التقليدية اللوني20. عندما يتم الجمع بين ربلك درجة الحموضة العالية ذات بعد ثاني من ربلك درجة الحموضة المنخفضة، التحليل الديناميكي وتغطية البروتين يتم تحسين، أسفر عن القدرة على تحديد الجزء الأكبر البروتينات المعرب عنها عند إجراء تحليلات البروتين كل15 ،16،،من1718. التطورات التقنية الأخرى تشمل C18 جزيئات صغيرة (1.9 ميكرومتر) وتمديد فترة طويلة العمود (~ 1 م)19. وعلاوة على ذلك، تتضمن التحسينات الملحوظة الأخرى الإصدارات الجديدة من المطيافات الشامل مع معدلات المسح السريع وتحسين حساسية والقرار20وأنابيب المعلوماتية المتطورة لمرض التصلب العصبي المتعدد البيانات التعدين21.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصلة تتضمن المنهجيات الأخيرة مع بعض التعديلات لتحسين حساسية والإنتاجية، مع التركيز على آليات لمراقبة الجودة في جميع أنحاء هذه التجربة. ويتضمن البروتوكول استخراج البروتين والهضم والحديد 10-من نوع plex وسم والأس الهيدروجيني القاعدي وتجزئة ربلك حامضي، الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد عالية الاستبانة وتجهيز البيانات MS (الشكل 1). وعلاوة على ذلك، علينا أن ننفذ عدة خطوات مراقبة الجودة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها وتقييم التباين التجريبية. هذا البروتوكول مفصلاً يهدف إلى مساعدة الباحثين جديدة إلى الميدان بشكل روتيني تحديد ودقة كوانتيتاتي آلاف بروتينات من أو الأنسجة.
يمكننا وصف بروتوكول الفائق كوانتيتيشن البروتينات مع استراتيجية التوسيم isobaric 10-من نوع plex، التي نفذت بنجاح في عدة منشورات12،،من1314،32 . في هذا البروتوكول، يمكننا تحليل عينات البروتين البيولوجي مختلفة تصل إلى 10 في التجربة 1…
The authors have nothing to disclose.
يشكر المؤلفون سائر أعضاء المختبر ومرفق لمناقشة مفيدة. هذا العمل كان تدعمها جزئيا منح ح ني R01GM114260، R01AG047928، R01AG053987، والساك. تم إجراء تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد في الأطفال سانت جود “مستشفى البروتيوميات منشأة الأبحاث”، معتمدة بشكل جزئي بمنحه “دعم مركز السرطان المعاهد الوطنية للصحة” P30CA021765. يشكر المؤلفون نيشا باديرس للمساعدة في تحرير المخطوطة.
1220 LC system | Agilent | G4288B | |
50% Hydroxylamine | Thermo Scientific | 90115 | |
Acetonitrile | Burdick & Jackson | AH015-4 | |
Bullet Blender | Next Advance | BB24-AU | |
Butterfly Portfolio Heater | Phoenix S&T | PST-BPH-20 | |
C18 tips | Harvard Apparatus | 74-4607 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545 | |
DMSO | Sigma | 41648 | |
Formic acid | Sigma | 94318 | |
Fraction Collector | Gilson | FC203B | |
Glass Beads | Next Advance | GB05 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma | I6125 | |
Lys-C | Wako | 125-05061 | |
Methanol | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive HF | |
nanoflow UPLC | Thermo Scientific | Ultimate 3000 | |
ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um | Dr. Maisch GmbH | r119.aq.0003 | |
Self Pck Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | |
Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
Speedva | Thermo Scientific | SPD11V | |
TMT 10plex Isobaric label reagent | Thermo Scientific | 90110 | |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Applied Biosystems | 400003 | |
Trypsin | Promega | V511C | |
Urea | Sigma | U5378 | |
Xbridge Column C18 column | Waters | 186003943 | |
Ziptips C18 | Millipore | ZTC18S096 | |
SepPak 1cc 50mg | Waters | WAT054960 |